鸡NCOA1基因发育性表达模式的研究

应用实时荧光定量PCR技术,以不同繁殖性能的母系(S3系)、父系(Y、F、D系)为研究对象,研究了鸡NCOA1基因不同发育时期在下丘脑、垂体、卵巢、肝脏和血液中的相对表达量及表达模式.结果表明,NCOA1基因在鸡性腺轴组织中高水平表达,NCOA1基因在组织中的表达量与鸡性腺发育和产蛋性能呈相似的变化规律.随着生长发育的...     

SIRT1基因在绵羊不同组织器官中的差异性表达研究

SIRT1(silent mating type information regulation 2homolog1)是一种具有NAD+依赖性去乙酰化酶活性的转录调节因子,参与能量代谢的调节。利用实时荧光定量PCR技术,对10月龄山西肉用绵羊母本品系去势公羊内脏(肝、肾、脾、肺、心)、肌肉(背最长肌)和脂肪(大网膜、小网膜、肠系膜、腹膜后、皮下)等11种器官或组织中SIRT1基因mRNA的表达量进行检测,以探讨SIRT1基因的差异性表达规律。结果表明,绵羊SIRT1基因在所检测的器官或组织中均有表达,且差异极显著(P0.001)。主要表现在脾脏、肝脏和肾脏中的表达显著高于心脏和肺脏中的表达;深层脂肪组织中的表达高于浅层的皮下脂肪;在背最长肌中也有较高表达。这些差异与绵羊SIRT1基因调节脂质代谢及糖异生有关。有关结果为研究SIRT1基因的功能奠定了科学依据。     

水稻护颖发育相关基因的研究进展

水稻(Oryza sativa L.)花序和小穗的结构特点是决定水稻产量的重要因素。在禾本科植物中,护颖是水稻特有的小穗器官。一些调控护颖发育的基因,也参与其他花序或小穗器官的调控。护颖发育相关基因的研究对阐明水稻花发育的分子机制具有重要意义。本文介绍了与护颖发育直接相关的12个基因的研究进展,并根据突变体表型以及基因功能特点,将这12个基因分为开花决定基因、花序分生组织特征基因和花器官特征基因3类。根据已有研究结果和合理的假设,绘制调控护颖发育基因的互作模式图,并提出值得进一步探索的方向。     

苹果梨果实着色相关PAL基因片段克隆及表达分析

以苹果梨果皮为试材,克隆了苹果梨果实着色相关PAL基因片段,GenBank登录号为JN120855。结果表明:该基因片段长度为407bp,与鸭梨PAL基因序列一致性达97%,与鸭梨氨基酸序列同源性最高,酶切位点分析表明,该PAL基因序列含有常用的限制性内切酶AccI的识别位点。半定量RT-PCR分析表明,随着果实的成熟,套袋果与未套袋果PAL基因的表达量都不断增加,但套袋果在果实成熟期的表达量明显高于未套袋果。     

细胞自噬相关基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的定量分析

在前期研究中,采用RNA-seq技术获得了在水稻纹枯病菌菌核发育过程中差异表达的6个自噬相关基因,为阐明这些基因在水稻纹枯病菌菌核发育过程中的表达模式,提取了菌核发育过程中3个阶段的RNA,根据特异基因的序列设计引物,采用实时荧光定量PCR技术分析这些基因的表达谱。结果表明,丝氨酸/苏氨酸激酶和ssp1、ATG13和Vam6基因的表达量在白色菌核形成阶段的表达量显著升高,而在菌核发育成熟阶段的表达量明显下降。而丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶基因和丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白基因的表达量在菌核发育阶段呈现出连续下降的趋势。研究发现这6个与细胞自噬有关的基因的表达谱与转录组测序的结果一致,表明转录组测序的结果可靠;同时也表明了这些基因高度响应了菌核的发育过程。     

水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性条斑病是我国水稻上的检疫性病害之一。设计并筛选出特异性引物对Xoc2071F/Xoc2071R(Xoc2071),其扩增片段大小为329bp,利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法进行水稻细菌性条斑菌的实时荧光PCR检测。结果表明,引物对Xoc2071能特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其他菌种不产生荧光信号。检测的灵敏度是2.25fg/μL质粒DNA和1.0×102cfu/mL的菌悬液,相当于1个细菌的基因,比常规PCR电泳检测的灵敏度高约100倍。此实时荧光PCR可以检测到仅需10g的带菌种子上目标菌的存在。     

BpAP1转基因白桦中开花相关基因的时序表达

为揭示白桦(Betula platyphylla×B.pendula)中Bp AP1转录因子的调控机理,以Bp AP1过表达、抑制表达转基因白桦以及非转基因对照白桦(NT)为试材,对前期获得的Bp AP1转基因白桦中的6条开花相关基因(BpPI、Bp MADS4、Bp MADS5、FT、TFL1和LFY)进行了定量PCR分析,探讨了白桦Bp AP1转录因子与这6条开花基因的表达调控关系以及它们对白桦提早开花的影响。结果表明:非转基因对照与Bp AP1抑制表达转基因白桦叶片中Bp AP1、Bp PI、Bp MADS4、Bp MADS5、FT、TFL1和LFY的相对表达量在不同发育时期变化均不显著。Bp AP1过表达转基因白桦叶片和雄花序中这7条基因的表达量在不同发育时期均显著高于NT和Bp AP1抑制表达转基因白桦。在Bp AP1过表达转基因白桦中,除Bp AP1和TFL1外,其他5条基因在各个时期的雄花序中表达量均为最高,多数基因的表达高峰出现在6月15日;另外,Bp AP1、Bp MADS4、Bp MADS5和Bp PI在8月15日的雄花序中表达量也很高;TFL1的相对表达量在9月1日的叶片中显著上调;LFY基因在生长发育最旺盛的6、7月份的雄花序中达到了表达高峰。Bp AP1与Bp PI、Bp MADS4、Bp MADS5、FT、TFL1、LFY这6条开花相关基因之间均呈极显著的正相关。     

水稻多逆境响应新基因OsMsr9的表达与克隆

为发掘水稻新的耐逆基因,研究植物在应答逆境胁迫时的分子机制,我们采用Affymetrix水稻表达芯片分析了超级稻两优培九母本培矮64S全基因组在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一批表达水平显著改变的基因。其中基因OsMsr9(Oryza sativa L.Multiple Stresses Responsive Gene9,GenBank登录号为EU276058)的表达量在高温、低温、干旱处理后在多个组织器官、发育时期均有显著提高。实时定量PCR分析其特定时空表达量的结果与基因芯片的结果基本吻合。通过RT-PCR法,得到包含OsMsr9完整ORF(open reading frame)的cDNA克隆。根据生物信息学分析,该ORF编码一个包含168个氨基酸残基的蛋白质,与玉米(Zea mays)中含F-box结构域的全长蛋白有大约58%的相似性,而F-box蛋白可能与植物抗逆性有关。基于上述实验及分析结果,OsMsr9可能是一新的水稻耐逆功能基因。     

水稻ISA1基因的克隆与分析

[目的]克隆水稻ISA1基因,分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[方法]以粳稻品种日本晴为试验材料,采用半定量RT-PCR技术分析ISA1基因在不同组织和不同灌浆期胚乳中的表达情况。[结果]水稻淀粉去分支酶1cDNA序列ORF编码811个氨基酸残基;同源性比较和系统进化树分析表明,水稻ISA1基因与其他物种已发表的ISA1基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别在66.8%～83.0%和69.0%～83.3%,且与大麦、小麦等物种亲缘关系最近;半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在叶、根、茎中不表达,在灌浆期12d胚乳中的表达量最大。[结论]该研究结果为进一步研究ISA1基因的表达和调控机制奠定了基础。     

2个育性恢复基因Rf1a和Rf1b在红莲型水稻中的表达量分析

[目的]探究红莲型水稻细胞质雄性不育(CMS)与不同恢复基因之间的作用模式。[方法]利用特异性引物结合荧光定量PCR技术,在红莲型水稻近等恢复基因系L-Rf5、L-Rf6,恢复系9311和不育系粤泰A(YTA)中检测2个包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的表达量。[结果]Rf1a在L-Rf5、L-Rf6、9311中都能表达,而Rf1b只能在部分材料或部分组织中表达。对同一时期二者的表达量分析发现,L-Rf5和9311的相同组织中Rf1a表达水平显著高于Rf1b,L-Rf6叶片中Rf1a的表达量则低于Rf1b。[结论]该研究结果对研究红莲型恢复系的遗传多样性具有一定的参考价值。     

杂交稻蔗糖/质子同向转运体基因家族时空表达差异研究

蔗糖/质子同向转运体在植物碳素分配中起着重要作用.已有研究表明:水稻中有5个蔗糖/质子同向转运体基因家族成员.该研究根据5个OsSUTs基因家族成员的序列,分别设计特异引物,采用半定量RT-PCR技术,研究了5个成员在富优1号杂交稻各器官、富优1号三系以及其它10个杂交稻的幼根与幼叶中的表达差异.结果表明:OsSUT2是杂交稻所有材料中同化物转运的主要蔗糖转运体;OsSUTs基因家族其它成员的表达具有较大的波动性和不稳定性.OsSUT2可能是杂交稻同化物转运控制的理想目标.     

水稻花器官数目异常突变体afon1的表型分析与基因定位

【目的】研究水稻花器官数目异常突变体afon1(abnormal floral organ number1)的分子机理,鉴定出控制水稻花器官数目变化的基因。【方法】利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种浙农34获得一个花器官数目异常突变体作为试验材料,命名为afon1。开花期随机取突变体afon1和野生型浙农34的稻穗各5个,利用组织学和扫描电子显微镜等技术研究afon1的花器官表型、细胞学特征和花粉育性。成熟期随机取突变体afon1和野生型浙农34植株各10株,测定株高、分蘖数、穗长、每穗颖花数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状。随机取突变体afon1和野生型饱满种子各100粒,测定发芽势和发芽率。以突变体afon1为母本,分别与野生型浙农34和粳稻品种浙农大104杂交构建2个F2群体进行遗传分析和基因定位,筛选候选基因进行DNA测序比对,构建AFON1蛋白质的空间模型并对其结构进行分析,同时对候选基因以及与花器官数目相关的基因进行实时荧光定量PCR分析。【结果】与野生型相比,突变体afon1中59.64%小穗的花器官数目发生异常,其中多数小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状的器官,部分小穗表现2—4轮花器官数目同时增加;株高和千粒重显著增加,而结实率显著降低。遗传分析表明,突变体afon1与野生型浙农34杂交的F1植株小穗花器官数目表现正常,F2群体中小穗花器官数目正常植株与花器官数目异常植株的分离比符合3﹕1,表明突变体afon1性状受一对隐性核基因控制,基因位于水稻第1染色体长臂端In Del标记1M5和1M18之间,物理距离为73 kb,该区间内共有6个注释基因。突变体afon1和野生型的测序比对发现,突变体afon1中的基因LOC_Os01g67430外显子中第565个碱基T突变成A,导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。蛋白质序列和空间结构分析表明,AFON1蛋白质序列中含有一个Lipase_3结构域,结构域内的突变导致蛋白质的空间结构发生了明显的变化。实时荧光定量PCR结果显示,LOC_Os01g67430在突变体afon1幼穗中的表达量要显著高于野生型,而在根、茎和叶中则无显著差异;穗发育早期FON1和FON2/4等调控花器官数目的基因在突变体afon1花器官中的表达量显著增加。【结论】LOC_Os01g67430为突变基因afon1,该基因通过影响花器官数目相关基因的表达而调控各轮花器官数目。     

Study on Floral and Pollen Characters of Tetraploid Rice

Polyploidization is the evolution trend of many crops, and the yield increased obviously after polyploidization. The polyploidization of rice often brings ＂gigas＂ of both vegetative organs and seeds. Howevere, in rice breeding, it is required for restoring lines to have not only big anthers but also abundant pollens. People often doubt that the enlargement of the floral organ may just be enlargement of cell size in polyploid rice. So, it is of significance to study characteristics of floral organs and pollens of several tetraploid rice varieties or lines. Floral organ and pollen characteristics of Sg99012 and HN2026 were studied comparatively by stages and different ploidy levels, with the materials 9311, HD9802S, and PA64S as the control. The results showed that chromosome doubling had much more influence on floral characteristics of every lines than seeding by stages, and the tetraploids of every lines displayed ＂gigas＂. In correlation analysis, spikelet length, spikelet width, and anther length had significant correlation; spikelet width and anther width had significant correlation, too. Both seeding by stages and chromosome doubling made the correlations of characters between every floral organ changed to some extent. Seeding by stages had little effect on pollen diameter and fertility of HN2026-4X and Sg99012-4X. But chromosome doubling increased pollen size of every lines remarkably, and also increased the pollen quantity of PMeS （polyploid meiosis stability） restoring line HN2026-4X and gene map restoring line 9311-4X remarkably, whereas only had little effect on that of sterile lines. Moreover, chromosome doubling changed pollen fertility and made the number of fertility pollen of 9311 reduced significantly, but the pollen fertility of HN2026 （PMeS restoring line） and PA64S （sterile line） almost had no change after chromosome doubling. The results showed that tetraploid restoring lines had advantage of abundant and big size pollens, and tetraploid sterile lines had the characters of big size pollens, few change of pollen quantity and stable sterile character. These results provided evidence in reproductive biology for utilizing heterosis of polyploid rice by two-line method.     

甘蔗苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗的苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）,分析其序列特征及其在不同组织和5种胁迫条件下的表达情况,为此基因在甘蔗抗逆育种中的应用提供理论支撑。【方法】利用串联飞行时间质谱仪对差异表达蛋白质进行质谱鉴定分析,通过RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆PAL,以生物信息学方法对其序列进行预测分析,利用real-time PCR分析PAL在不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗PAL,命名为ScPAL,GenBank登录号为KC172559。该cDNA全长2 590 bp,含有1个2 115 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码704个氨基酸。序列分析表明,其包含典型的PAL酶活性中心序列（GTITASGDLVPLSYIA）,与其它植物的PAL蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScPAL与高粱的PAL蛋白亲缘关系较近。real-time PCR分析表明PAL为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的66倍。其在低温（4℃）、聚乙二醇（PEG）、NaCl和H2O2四种外源胁迫下均诱导表达,但表达模式不同。【结论】从甘蔗品种ROC22中克隆获得苯丙氨酸解氨酶基因（ScPAL）,是典型的PAL家族成员,推测其参与了甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱和抗盐胁迫过程也起到某种作用。     

光周期对棉花愈伤组织发生及体胚发生相关基因表达的影响

[目的]研究光周期对棉花愈伤组织发生及体胚发生相关基因表达的影响.[方法]利用石蜡切片对不同培养时期下胚轴细胞形态进行观察;RT-PCR技术对体胚发生相关基因表达量进行分析.[结果]石蜡切片观察发现,光处理后继代培养3d的下胚轴在b处理(暗处理3d后光处理3d)下形成层细胞增殖较快;继代培养7d时,新陆早33号、45号、50号和珂字棉312号在皮层部位都观察到次生分生细胞团的出现;其中,新陆早45号在b处理和c处理(暗处理12 h后光处理12 h,培养6d)下以及珂字棉312在四个光周期处理下形成层部位也观测到明显的次生分生细胞团.实时荧光定量PCR表明,光周期b处理下的下胚轴材料GhLEC1、GhSERK1基因相对表达量较高.[结论]光周期b处理更有利于愈伤组织发生,并且该处理下体胚发生相关基因的表达量相对最高.     

11种杀虫剂对松墨天牛肌肉LIM蛋白基因表达的影响

松墨天牛（MonochamusalternatusHope）是松树的重要蛀干害虫,也是松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）的主要传播媒介。试验从松墨天牛文库中分离得到肌肉LIM蛋白基因的部分cDNA序列,长度为871 bp,命名为MaLIM（GenBank：KJ872589）;与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和家蚕（Bombyxmori）氨基酸相似性分别为77%和75%。用RT-qPCR测定了11种杀虫剂对MaLIM相对表达量的影响,结果表明,杀虫剂处理后MaLIM基因的表达量均有所下降,仅为对照的0.03~0.53。     

水稻TWH1基因启动子的克隆及表达分析

启动子是基因表达的重要调控元件。利用PCR方法克隆了控制水稻颖壳发育的候选基因TWH1的启动子,并将启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体。通过农杆菌介导的方法将其导入水稻愈伤组织,转基因植株经GUS染色分析显示,各个发育时期的茎秆、叶片、叶鞘、雌雄蕊和孕穗期的颖壳中都有GUS活性表达,但在根和抽穗后的颖壳中未检测到GUS活性。该结果对进一步研究TWH1基因的功能奠定了基础。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

虫酰肼对斜纹夜蛾幼虫多巴脱羧酶基因表达的影响

【目的】克隆斜纹夜蛾（Spodoptera litura）多巴脱羧酶（dopa decarboxylase,DDC）基因cDNA全长,研究虫酰肼对表皮形成过程中多巴脱羧酶基因表达的影响。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆得到斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的cDNA全长;通过生物信息学工具对斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列进行分析;采用饲料浸毒法测定虫酰肼对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的毒力;利用荧光实时定量PCR检测用亚致死剂量虫酰肼处理的斜纹夜蛾幼虫DDC基因的表达水平。【结果】克隆了斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因的cDNA全长,开放阅读框为1 263 bp,编码420个氨基酸,5′端非编码区长105 bp,3′端非编码区长79 bp。克隆得到的cDNA全长提交至GenBank,登录号为KF620492。多重序列比对及系统进化树显示斜纹夜蛾DDC基因推导的氨基酸序列与鳞翅目昆虫的DDC序列具有很高的相似性。利用SWISS-MODEL在线工具进行同源建模,成功预测斜纹夜蛾DDC三维结构,其与果蝇属（Drosophila）的多巴脱羧酶空间结构具有很高的相似性,功能结构域具有良好的保守性。测定虫酰肼对斜纹夜蛾3、4、5和6龄幼虫的毒力,其LC50分别为33.32、40.28、71.20和71.97 mg•L-1。DDC转录表达结果显示,用虫酰肼分别处理12-48 h,4个亚致死剂量（7.50、16.24、28.34和45.63 mg•L-1）诱导的DDC表达水平均显著高于对照,随着处理时间的延长激活作用呈现出先上升后下降的趋势,其中16.24 mg•L-1亚致死剂量在24、36和48 h诱导表达水平最高,各处理36 h表达水平最高。处理60 h,4个亚致死剂量的表达水平均显著低于对照。这一结果说明虫酰肼进入虫体后先启动基因表达,而后抑制表达,影响昆虫正常蜕皮。【结论】克隆得到斜纹夜蛾多巴脱羧酶基因cDNA全长,虫酰肼干扰昆虫幼虫蜕皮与其影响表皮形成过程中多巴脱羧酶基因的表达有关。