南方5省区柑橘黄龙病病原16αSrDNA片段的克隆与序列分析

采集了广东、广西、贵州、福建、云南5省区的8个柑橘黄龙病样品,利用黄龙病病原的特异引物对其16SrD—NA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收,并与pMD18-TVector连接,转化大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α,筛选含有黄龙病病原16SrDNA片段的阳性克隆,进行序列测定。利用生物信息学软件对所克隆的序列进行同源性分析和聚类分析．结果表明：来自我国南方5省区的柑橘黄龙病病原16SrDNA的序列与亚洲种（L22532）的同源性为96．9％～98．6％,与非洲种（L22533）的同源性为94．5％～97．1％,与美洲种（AY742824）的同源性为92．5％-94．2％．表明我国南方5省区柑橘黄龙病均属于亚洲种,但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原也发生了微小的变异,其中福建厦门和云南个旧的2个菌株变异较大．     

南方5省区柑橘黄龙病病原16S rDNA片段的克隆与序列分析

采集了广东、广西、贵州、福建、云南5省区的8个柑橘黄龙病样品,利用黄龙病病原的特异引物对其16S rD-NA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收,并与 pMD18-T Vector 连接,转化大肠杆菌(Esherichia coli)DH5α,筛选含有黄龙病病原16S rDNA片段的阳性克隆,进行序列测定.利用生物信息学软件对所克隆的序列进行同源性分析和聚类分析.结果表明:来自我国南方5省区的柑橘黄龙病病原16S rDNA的序列与亚洲种(L22532)的同源性为96.9%～98.6%,与非洲种(L22533)的同源性为94.5%～97.1%,与美洲种(AY742824)的同源性为92.5%～94.2%.表明我国南方5省区柑橘黄龙病均属于亚洲种,但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原也发生了微小的变异,其中福建厦门和云南个旧的2个菌株变异较大.     

柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为3.44％.     

肇庆地区柑橘内生菌16S rDNA克隆与序列分析

[目的]研究柑橘黄龙病病原及其分化.[方法]采集肇庆周边各区县柑橘黄龙病的枝、叶共计8个黄龙病样品,利用黄龙病内生菌的细菌通用引物对其16S rDNA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收、克隆后,转化大肠杆菌,提取质粒,进行序列测定.[结果]所克隆的序列与众多的Uncultured bacterium都有极高的相似度,其序列在同源性检测中,与其相似度最高的是Uncultured bacteriumclone yf5-180,达到91.3％.[结论]表明肇庆周边黄龙病柑橘的枝、叶内生菌可以扩增出特异性16S rDNA片段,该序列属于一个新的细菌种属.     

柑橘黄龙病病原培养及分子检测技术研究进展

柑橘黄龙病（Huanglongbing）由韧皮部杆菌属细菌（Candidatus Liberobacter sp.）侵染引起,是柑橘生产上的毁灭性病害,当前正在世界柑橘产区迅速蔓延,已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。介绍了柑橘黄龙病的症状以及病原的分离培养研究进展,阐述了病原的分子检测技术,包括PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR和LAMP快速检测技术,并对病害的防控进行展望。     

柑橘黄龙病检测方法研究进展

黄龙病是柑橘生产上的一种毁灭性病害,该病在北美、南美、西亚、东亚和南亚的一些国家和地区时有发生,造成巨大的经济损失,严重威胁着世界柑橘产业。柑橘黄龙病的传统检测方法有病害田间诊断、指示作物鉴定、病原显微镜观察、血清学、DNA-DNA杂交和PCR检测等方法。近年来,美国一些科学家把高光谱图像技术应用在柑橘黄龙病检测领域,提高了检测速度,降低了检测成本。综述了国内外关于柑橘黄龙病检测诊断方面的研究进展,介绍了该领域传统检测方法的特点和存在问题以及高光谱图像检测技术的主要特点,着重介绍了高光谱图像技术在黄龙病检测方面的最新应用技术、设备和实例。提出了柑橘黄龙病诊断领域,在实现无损检测的前提下,降低成本、提高检测实时性和诊断速度的发展趋势。     

琯溪蜜柚黄龙病病原的克隆及序列分析

Guan溪蜜油是中国大陆柚类中的优质品种。近年来，在福建省的产地发现Guan溪蜜油叶片表现斑驳的病树，其叶片斑驳与柑桔黄龙病的叶片病状十分相似。据实验结果证明：该病能通过病梢嫁接传染到柚和柑桔的健苗；在电镜下观察到病株韧皮部寄生着大量BLOs，其形态和构造均与柑桔黄龙病病原（Liberobacter asiaticum)相似，经PCR扩增与Southern Blot分子杂交测定，表明该病原DNA PCR产物与柑桔黄龙病病原PCR产物之间具有很高的同源性。初步认为该病很可能是柑桔黄龙病引起的。为了进一步明确该病与柑桔黄龙病的关系，对病原DNA片段进行扩增、克隆和序列分析，并与柑桔黄龙病病基因相应序列进行比较，结果表明该病原与亚洲柑桔黄龙病病原（Lasiaticum）相应基因序列的同源率达94．2％，而与非洲柑桔黄龙病病原（L.africa num)的同源率仅为75．0％。进一步证明Guan溪蜜油叶片斑驳是柑桔黄龙病引起的，其病原是L.asiaticum中的一个成员。     

欢迎订阅2008年《华南农业大学学报》

采集了广东、广西、贵州、福建、云南5省区的8个柑橘黄龙病样品,利用黄龙病病原的特异引物对其16SrD—NA片段进行PCR扩增,将其扩增产物纯化、回收,并与pMD18-TVector连接,转化大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α,筛选含有黄龙病病原16SrDNA片段的阳性克隆,进行序列测定。利用生物信息学软件对所克隆的序列进行同源性分析和聚类分析．结果表明：来自我国南方5省区的柑橘黄龙病病原16SrDNA的序列与亚洲种（L22532）的同源性为96．9％～98．6％,与非洲种（L22533）的同源性为94．5％～97．1％,与美洲种（AY742824）的同源性为92．5％-94．2％．表明我国南方5省区柑橘黄龙病均属于亚洲种,但在亚洲种内部不同地区的黄龙病病原也发生了微小的变异,其中福建厦门和云南个旧的2个菌株变异较大．     

柑橘黄龙病病原DNA提取方法比较

柑橘植物组织中富含多糖、酚类、单宁、色素等物质,它们的存在严重干扰了柑橘黄龙病PCR检测的准确性.因此有必要筛选出一种能得到纯度高、结构完整的柑橘总DNA(含黄龙病病原DNA),且操作简便的提取方法.本研究对比试验了3种柑橘总DNA提取方法,方法1采用Sandrine等人的提取法;方法2采用CTAB法;方法3采用试剂盒法.实验研究表明,方法2提取柑橘黄龙病病原DNA的PCR检测准确率最高.     

柑橘黄龙病检测技术研究进展

冠以“柑橘（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｂｌａｎｃｏ．）癌症”之称的黄龙病暂被认为是由韧皮部难养细菌引起的对柑橘产业造成严重威胁的毁灭性病害,它给柑橘产业的健康发展造成了严重的威胁．鉴于柑橘黄龙病检测技术对柑橘黄龙病防治的重要性,文章对柑橘黄龙病及其病原、黄龙病的检测技术进行了综述,并对柑橘黄龙病的检测技术未来发展进行了展望.     

柑橘黄龙病分子生物学检测方法研究进展

柑橘黄龙病是世界范围内极具破坏性的危险性病害,可防可控但不可治,加强黄龙病早期诊断,探索快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测技术对防止该病害的传播蔓延具有极其重要的意义。综述了国内外关于柑橘黄龙病分子生物学检测诊断方面的研究进展,介绍了该领域各检测方法的特点和存在问题,主要介绍了PCR检测技术,提出了大批量黄龙病样品检测适宜选用巢式PCR检测方法。     

广西柑橘黄龙病植株韧皮部内生细菌多样性分析

【目的】对柑橘健康植株和感染黄龙病植株的韧皮部内生细菌的多样性进行比较分析,为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关系奠定基础。【方法】采用常规分离培养与分子鉴定的方法和基于16S rDNA基因的限制性酶切长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析的方法。【结果】用常规分离与分子鉴定方法获得10个属细菌类群,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)为无症健株的优势菌群;微杆菌属(Microbacterium sp.)、芽孢杆菌属、假单胞菌属和考克氏菌属.为黄龙病罹病植株的优势菌群。PCR-RFLP方法得到29种酶切图谱,共鉴定出10属可培养细菌以及11种不可培养细菌。健株与病株中Dyella sp.、Pseudomonas sp.、Serratia sp.和未培养细菌所占比例均大于5%。柑橘健株与病株中细菌的种群密度和菌群种类存在明显差异。【结论】研究结果表明柑橘健株和病株韧皮部组织中的内生细菌优势菌群存在明显差异,而伴生细菌的优势菌群与黄龙病菌的相互关系正在深入分析研究。     

四川安岳柑橘衰退病病原鉴定及序列分析

[目的]探明引起四川安岳柑橘衰退病的病原。[方法]利用RT-PCR、克隆、测序等技术对四川安岳地区的柑橘类果树进行柑橘衰退病毒(CTV)检测,并对其外壳蛋白(CP)全序列进行了分析。[结果]81个疑似CTV侵染的样品中共有18个检测呈阳性,检出率为22.2%,表明安岳地区柑橘类果树衰退病由CTV引起。基于CP全序列同源性比较及进化分析表明,危害该地区柑橘类果树的CTV分属5个组群,亲缘关系较复杂。[结论]为安岳地区CTV的防控与防治提供了理论依据。     

柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列的克隆及分析

 【目的】克隆柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列并和亚洲种相应区域进行比对,阐明黄龙病3个种核糖体RNA操纵子之间的关系。【方法】根据亚洲种23S-5S rRNA基因区域序列的保守性设计引物,在非洲种和美洲种DNA样品上扩增,对PCR产物进行克隆和测序,并对新获得的序列进行序列验证和分析。【结果】 非洲种获得了3 057 bp 序列包括23S rRNA 基因、细胞壁脱氢酶假基因和5S rRNA 基因;美洲种获得了3 033 bp序列包括23S rRNA 基因、glpK基因和5S rRNA 基因。3个种核糖体基因顺序分别是：亚洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因、5S rRNA 和 tRNAMet;非洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、细胞壁脱氢酶假基因和 5S rRNA;美洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S rRNA、glpK 基因和5S rRNA。【结论】黄龙病病原菌核糖体RNA基因有特殊的排列方式,即在23S rRNA和5S rRNA基因区间均有反向编码的细胞壁脱氢酶基因,其中亚洲种和非洲种为假基因,美洲种为glpK基因。     

中国柑橘黄龙病研究30年

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是由韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)引发的重要柑橘病害。本试验利用生物信息学方法分析韧皮部杆菌全基因组,推测CLIBASIA_03230基因(命名为Clsp11)编码分泌蛋白,克隆该基因并构建其原核表达载体,表达、纯化Clsp11蛋白,以用于制备特异抗体。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t利用CTAB法从感染柑橘黄龙病病原的长春花中提取总DNA,以此为模板经PCR扩增Clsp11,并克隆至pMD18-T载体,挑取阳性克隆测序验证;利用无缝克隆技术将Clsp11克隆至原核表达载体pET30a,通过PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,命名为pET30a-Clsp11;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达N-端融合6×His标签的Clsp11重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,分析目的蛋白的表达水平,并利用镍柱进行纯化。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\tClsp11蛋白成功表达,IPTG诱导5 h表达量显著提高,主要以包涵体形式存在于宿主菌中。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t本研究克隆了柑橘黄龙病病原Clsp11基因,构建了原核表达载体pET30a-Clsp11,并成功表达、纯化了Clsp11重组蛋白,为进一步制备特异性抗体和研究Clsp11生物学功能奠定了基础。\t\t\t\t\t\t\t\t\t     

柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法的建立

黄龙病是世界柑橘产业的毁灭性病害,引起柑橘黄龙病的病原分为亚洲种、非洲种和美洲种共3个种,目前我国柑橘黄龙病均由亚洲种引起,建立一套快速检测技术对我国柑橘黄龙病的防控具有重要意义.本研究根据柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列设计引物,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的检测方法,并评价了该方法的灵敏度和检测准确性.结果表明,本研究所建立的柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法特异性强、灵敏度高、操作过程简便,检测灵敏度比常规PCR提高10倍,为基层农技人员开展柑橘黄龙病的快速检测提供了一种新方法.     

应用PCR技术检测柑桔黄龙病病原的研究

应用ＰＣＲ技术检测柑桔黄龙病病原的研究邓晓玲唐伟文（华南农业大学植物保护系，广州，５１０６４２）ＴＨＥＳＴＵＤＩＥＳＯＮＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＣＩＴＲＵＳＨＵＡＮＧＬＯＮＧＢＩＮＰＡＴＨＯＧＥＮＢＹＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＣＨＡＩＮＲＥＡＣＴＩＯＮＤｅｎ...     

柑橘黄龙病及其防治

柑橘黄龙病是世界性的柑橘病害,该病近两年在永春县呈扩大蔓延趋势。介绍柑橘黄龙病的发病症状、病原、传播途径与发病条件以及柑橘黄龙病的防治方法。     

柑桔黄龙病亚洲种病原(Candidatus Liberobacter asiaticus)16S rDNA 的PCR-SSCP分析

应用PCR—SSCP技术对我国柑桔主要产区、泰国和法国留尼湾等地收集到的柑桔黄龙病亚洲种病原（Candidatus Liberobacter asiaticus）16S rDNA进行了分析。PCR结果表明,不同的地区的柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA在长度上没有明显区别。进一步的SSCP结果显示,不同地区柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA序列在组成上也没有差异。显示来自不同地区、不同寄主品种的柑桔黄龙病亚洲种种内没有存在明显差异。     

日本柑橘黄龙病病原体电镜观察及PCR检测

对日本柑橘黄龙病病原体的形态结构进行了电镜观察,结果发现柑橘黄龙病病菌日本株系绝大多数是球形和短椭圆形,极少观察到棒状形态,直径为100～500nm,外被一层胶状物质包围,厚约10～50nm,这与其他地区发现的柑橘黄龙病病原体形态不同．PCR检测表明,以硅藻土法提取的DNA为模板,利用Ready-To-Go^TM PCR bead法可以得到理想结果。