甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

[目的]在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术.[方法]以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBuffer Ⅱ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定.[结果]优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA( 15.9 pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释10倍的Lxx基因组DNA( 159 pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定.对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7%,而常规的PCR检测RSD感染率为0.[结论]优化的PCR体系为:2xGC Buffer Ⅱ12.5 μL,Ex Taq DNA酶(5 U/μL)0.2 μL;dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL;Lxx1(10 μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μLcPCR反应程序为:95℃预变性10 min,94℃ 15s,57℃ 15 s,72℃ 30 s,40个循环;72℃延伸10 min.优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测.     

广西甘蔗宿根矮化病菌的PCR检测

为探索PCR在甘蔗宿根矮化病(RSD)病原菌检测上的应用，对采自广西各蔗区的甘蔗样本进行了PCR检测研究。结果显示：广西各蔗区甘蔗主栽品种及其他大部分引进和自育品种(系)材料均检出RSD病原菌Clavibacter xyli subsp.xyli(Cxx)，经过热水处理和组培脱毒健康种苗PCR检测呈阴性。PCR检测技术是一项灵敏度高、特异性的分子检测技术。     

甘蔗宿根矮化病菌多克隆抗体制备及初步检测

以纯化培养的甘蔗宿根矮化病(RSD)病菌作为抗原,免疫健康家兔,制备了RSD多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附试验检测其效价,并通过斑点酶标免疫法(Dot blot enzyme immunoassays,DB-EIA)确定其工作浓度,同时与澳大利亚的抗体比较。结果表明,制备的RSD多克隆抗体效价大于1∶10000,在用DB-EIA法检测样本时的工作浓度以稀释10倍较好;与澳大利亚抗体的检测结果一致,但在印迹着色方面比澳大利亚的浅一些。试验结果表明,自制RSD抗体的效价略低于澳大利亚RSD抗体,但检测效果较好,可以满足今后在甘蔗生产上对RSD的检测要求。     

广东甘蔗宿根矮化病菌的分离培养及鉴定

利用改良的SC培养基,从甘蔗蔗汁中分离培养到一种杆状细菌,根据菌落的形态特征,并结合血清学和PCR检测方法,确认所分离到的菌是甘蔗宿根矮化病的致病菌Leifsonia xyli subsp.xyli.该菌的分离培养在广东还是首次报道,这使分离高纯度的甘蔗宿根矮化病菌DNA成为可能,促进了该菌以DNA为基础的检测方法的发展,同时也为今后对该菌开展遗传多样性等研究奠定了基础.     

甘蔗脱毒健康种苗宿根矮化病的PCR检测

[目的]为甘蔗脱毒健康种苗宿根矮化病的检测提供好的方法。[方法]利用PCR技术对甘蔗脱毒健康种苗进行甘蔗宿根矮化病（RSD）病菌的检测研究。[结果]在甘蔗健康种苗生长的前几个不同时期（组培苗增殖、生根、丛苗沙培和单株假植阶段）,甘蔗宿根矮化病菌的检测结果均为阴性。对PCR检测灵敏度的研究表明,PCR能够检测到甘蔗宿根矮化病菌液浓度10-3。[结论]PCR检测特异性好、灵敏度高,适合甘蔗脱毒健康种苗生产中的大批量检测。     

甘蔗花叶病和宿根矮化病多重POR检测方法的建立

[目的]建立能同时检测甘蔗花叶病(sugarcane mosaic virus,SCMV)和宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)的多重PCR检测方法.[方法]以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR 引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种(Leifsonia xyli subsp.Xyli,Lxx) 的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单-PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法.[结果]此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV(400 bp)和RSD(265 bp)2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%, RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%.[结论]应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原.     

云南甘蔗宿根矮化病病原检测*

 利用从澳大利亚引进的甘蔗宿根矮化病病原（RSD）的标准抗原抗体，建立了I-ELISA检测甘蔗宿根矮化病的方法。采用电镜负染法和I-ELISA法，对采自云南红河、开远、新平蔗区的42个样本进行RSD检测，结果表明：29个样本为阳性，13个样本为阴性，确认云南蔗区存在RSD。     

宿根矮化病菌侵染后甘蔗防御酶活性变化

[目的]研究接种甘蔗宿根矮化病（Ratoon stuning disease,RSD）菌后甘蔗防御酶活性的变化,为进一步探明甘蔗与RSD病菌的互作机制提供理论依据.[方法]以温汤脱毒后的甘蔗品种桂糖1 1号（GT11）为材料,设RSD菌液浸种为处理,ddH2O浸种为对照,测定甘蔗茎、叶不同时期超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）等5种防御酶活性变化.[结果]在RSD病菌胁迫下,甘蔗茎和叶片中相关防御酶活性均有所变化,茎中除APX活性一直高于对照外,其他酶活性均表现为在90 d时低于对照,180d时高于对照;叶中除POD活性一直高于对照外,其他酶活性在90 d时高于对照,180 d时低于对照.[结论]在RSD病菌胁迫下,甘蔗茎和叶片中CAT、SOD、POD、APX及GR活性均有所提高,随着胁迫时间的延长在茎中出现逐渐高于对照的趋势,叶片则与此相反.     

甘蔗宿根矮化病菌PCR检测及目的片段核苷酸序列分析

根据甘蔗宿根矮化病(RatoonStuntingDisease,RSD)病原细菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli,Lxx)16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列设计的一对特异性引物,建立了甘蔗宿根矮化病PCR检测方法;同时对PCR扩增的目的片段核苷酸序列进行测定与分析。结果表明广东湛江蔗区RSD病菌16S-23SrDNA基因间隔区核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国路易斯安娜州RSD株系基因组相应区段核苷酸同一率接近100%,病菌高度的同源。而与近缘的木质部赖氏杆菌狗牙根变种(Leifsoniaxylisubsp.Cynodontis,Lxc)和形态上相近的马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.Michiganensis)基因组相应区段核苷酸同一率较低,存在明显的分化。     

甘蔗宿根矮化病的TBIA快速检测

利用从澳大利亚引进的RSD标准抗原抗体,研究建立了TBIA快速检测甘蔗宿根矮化病(RSD)的方法。通过对田间采集的样本进行检测,并用I-ELISA检测法验证,结果表明:TBIA能简便、快速、准确、有效的检测出RSD,且检测效率高,适合于田间大批量样品快速检测。该方法为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供了技术支撑。     

甘蔗花叶病和宿根矮化病多重PCR检测方法的建立

 【目的】建立能同时检测甘蔗花叶病（sugarcane mosaic virus,SCMV）和宿根矮化病（ratoon stunting disease,RSD）的多重PCR检测方法。【方法】以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种（Leifsonia xyli subsp. Xyli,Lxx）的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单一PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法。【结果】此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV（400 bp）和RSD（265 bp）2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%,RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%。【结论】应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。     

甘蔗脱毒健康种苗宿根矮化病的PCR检测（英文）

[目的]为甘蔗脱毒健康种苗宿根矮化病的检测提供好的方法。[方法]利用PCR技术对甘蔗脱毒健康种苗进行甘蔗宿根矮化病（RSD）病菌的的检测研究。[结果]在甘蔗健康种苗生长的前几个不同时期（组培苗增殖阶段、生根阶段、从苗沙培和单株假植阶段）,甘蔗宿根矮化病菌的检测结果均为阴性。对PCR检测灵敏度的研究表明,PCR能够检测到甘蔗宿根矮化病菌液浓度的10-3。[结论]PCR检测特异性好、灵敏度高,适合甘蔗脱毒健康种苗生产中的大批量检测。     

广西主要蔗区甘蔗宿根矮化病调查

[目的]调查广西主要蔗区甘蔗宿根矮化病(Ratoon stuning disease,RSD)的发生情况,了解其分布、危害程度及发生规律,为推广甘蔗健康种苗,有效防控RSD提供科学依据.[方法]2013~2014年在广西9个糖料蔗主产区进行RSD发生情况调查和田间取样,采用PCR对采集的蔗茎样品进行RSD检测,并按不同蔗区、不同品种、不同植期、不同蔗地类型的发病率分析广西蔗区RSD发生状况.[结果]在278个样品中有198个样品检测出RSD,检出率为71.2%;调查的9个主产区均检测出RSD,阳性检出率在58.3%~100.0%;采集的27个甘蔗品种(系)均检测出RSD,其中主栽品种ROC22发病严重,RSD检出率达80.8%;新植蔗的RSD检出率为36.0%,宿根蔗的RSD检出率为75.7%,宿根年限越长,RSD检出率越高;旱地蔗的RSD发病率比水田高18.1%(绝对值).[结论]RSD在广西普遍发生且发生严重,生产中急需推广甘蔗温水脱毒种苗和选育高抗且综合性状优良的甘蔗品种.     

宿根矮化病菌对甘蔗生长和内源激素的影响

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)是由Leifsonia xyli subsp.xyli引起的病害。为研究该病对甘蔗的生长和内源激素的影响,选择2个甘蔗品种新台糖22号(ROC22)和果蔗(Badila),采用桶栽种植分别进行3个处理:感染RSD病菌蔗株进行52℃温汤脱菌处理30 min、感染RSD病菌蔗株、健康蔗株(对照),在出苗后90、120、150、180 d测定株高和内源激素的含量,并利用PCR检测确定感病和健康蔗株。结果表明:感染RSD病菌蔗株的株高显著低于对照和温汤脱菌处理;感染RSD病菌处理植株的赤霉素(GA3)、生长素(IAA)含量明显低于对照和温汤脱菌处理,而脱落酸(ABA)含量则相反,感染RSD病菌处理的ABA含量明显高于对照和温汤脱菌处理;对照和温汤脱菌处理的株高和激素含量差异不显著。     

宿根矮化病菌对甘蔗茎细胞超微结构的影响

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease,RSD)病原细菌一般集中在甘蔗基部2～3节间处.利用透射电镜对感染RSD的甘蔗茎组织细胞进行超微结构观察,结果显示细胞内和细胞壁都发生了明显的病理变化.甘蔗茎细胞被RSD病原细菌侵染后,细胞内积累有大量分布不均的电子致密物质,这种物质可能与甘蔗茎细胞抵抗、减少或延迟RSD病原菌入侵的抗性机制相关.这些电子致密物质在感病细胞内均有出现,而正常细胞内没有.维管束导管细胞壁增厚,表面附着一层胶黏物质;有的细胞壁厚薄不均,局部变形断裂,成为细胞壁碎屑和纤维丝.     

甘蔗宿根矮化病菌形态特征及其对甘蔗光合作用的影响

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)病原物为革兰氏阳性菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)。采用透射电镜和扫描电镜观察Lxx离体培养物形态和感病蔗茎维管超微结构,并用光合仪测定感病甘蔗+1叶光合作用相关指标。结果表明:改良的MSC培养基适于Lxx生长,培养的菌体形态多样,有隔膜和简体;菌体内细胞质分布不均,有电子透明物、电子稠密物及隔膜;RSD病原菌寄居在木质部导管的纹孔和导管壁上,其内粘附许多颗粒状物质;感染RSD蔗株的光合速率、气孔导度、胞间CO2和蒸腾速率均低于健康蔗株,RSD可降低甘蔗的光合作用。     

我国蔗区甘蔗宿根矮化病发生情况的分子检测

为明确我国甘蔗产区(简称蔗区)甘蔗宿根矮化病(Sugarcane Ratoon Stunting Disease,RSD)的发生情况,从我国甘蔗主产区的12个蔗区收集甘蔗叶片样品598份,采用特异性引物通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法进行宿根矮化病的分子检测。结果表明,598份甘蔗样品中有99份能检测到RSD,平均检出率为16.56%。12个蔗区的RSD检出率各不相同,临沧蔗区的RSD检出率最高,为27.78%;南宁蔗区的RSD检出率最低,为4.88%。15个主要甘蔗栽培品种均能检测到RSD,阳性检出率为15.38%～44.44%,其中新台糖22号RSD发病最严重,阳性检出率为44.44%,海蔗22号RSD发病最轻,阳性检出率为15.38%。可见,宿根矮化病在我国甘蔗栽培品种中普遍发生。     

甘蔗宿根矮化病检测技术研究进展简述

甘蔗宿根矮化病(Clavibacter xyli subsp.xyliDavis et al.)是甘蔗的主要病害之一,于1944～1945年首先在澳大利亚昆士兰州甘蔗品种Q28上发现[1]。我国1986年确诊存在RSD之后,广东[2]、福建[3]、广西[4]曾对全省蔗区进行普查,结果表明