疯牛病与朊蛋白的研究进展

论述了疯牛病的发病历史与现状、疯牛病的临床症状与检测、朊蛋白与蛋白假说和疯牛病的致病机理等。此外,还讨论了治愈疯牛病的可能性。     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

马麝朊蛋白(PrP)基因的克隆和序列分析

从马麝的全血中提取基因组总DNA,用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPC)基因,并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的马麝PrP基因片段大约为771bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,即包含在单一外显子内的完整开放阅读框,与国外报道的同科动物PrP基因序列基本相同。马麝PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码5个八肽(九肽)重复Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Ala/Gly-Gly–Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和23个氨基酸的C-端信号肽。与白尾鹿(Odocoileusvirginianus)和麋鹿(Cervuselaphus)的PrP基因相比,其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为97.4%、97.9%和98.1%、97.7%。共发生15个碱基替换,其中10个为同义码替换,5个为异义突变,即G57A、S100N、N173S、T177N和M208I。     

中国实验小型猪朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已发表的猪朊蛋白基因（PRNP）序列设计特异性引物，进行PCR直接扩增，得到了中国实验小型猪（CEMP）的朊蛋白基因（PRNP），将其克隆到pGEM-TEasy载体中。序列分析表明上述CEMP的PRNP基因ORF区全长为774bp，编码257个氨基酸的前体蛋白，分子质量约为28．3ku，其PRNP序列与已发表的猪PRNP序列（L07623）差异微小，仅在第4位氨基酸残基处有变异（Ser→Asn）；绘制CEMP与其他15种属动物朊蛋白的氨基酸序列进化树发现，CEMP与多种哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列遗传距离比较接近，与水貂最近。而与禽类朊蛋白氨基酸的遗传距离较远。     

细胞型朊蛋白PrP~C与浮舰蛋白flotillin功能的研究进展

朊蛋白和脂筏是当今研究的热点。细胞型朊蛋白(PrPC)能够通过构象转变生成致病型的朊病毒(PrPSc),导致海绵状脑病的发生,但是目前关于PrPC的转变机制还不清楚。PrPC也是重要的信号转导蛋白,引发众多的信号转导事件。Flotillin属于新被命名为SPFH(stomatin/prohibitin/flotillin/HflK/C)的蛋白家族,是重要的脂筏标识性蛋白,它们不仅被动地担当着非胞膜窖脂筏的脚架,为蛋白质的相互作用和蛋白质复合体的组装以及信号转导提供平台,而且本身还主动地扮演着信号蛋白的角色,在许多的细胞事件中发挥重要作用。PrPC与flotillin能够发生相互作用,flotillin蛋白为PrPC的跨膜信号转导和PrPC转变成PrPSc提供了环境。本文重点综述了近5年来关于PrPC和flotillin蛋白功能的研究进展,尤其是信号转导方面的研究。     

表达中国小麦花叶病毒（CWMV）外壳蛋白基因增强烟草对CWMV的抗病性

  目的  中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus,CWMV）是引起小麦黄花叶病的重要病原之一。获得表达CWMV外壳蛋白（coat protein,CP）的转基因烟草Nicotiana benthamiana（OECP）并分析其抗病性,为培育小麦抗病材料奠定工作基础。  方法  利用体外重组DNA技术构建含有CWMV外壳蛋白基因的表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法,获得OECP。进一步利用Western Blot和PCR检测明确CWMV的外壳蛋白在OECP中能够正常的表达。  结果  部分转基因阳性植株出现矮化表型。此外,OECP阳性植株接种CWMV后7 d的定量分析表明,OECP中CWMV运动蛋白的表达量显著受到抑制。  结论  在烟草中表达CWMV的CP蛋白基因可显著增强烟草对CWMV的抗病性。     

偶蹄动物朊蛋白基因变异性和其系统发生关系分析

【目的】为明了偶蹄动物PrP基因的结构特征及其变异与结构、功能和朊粒病传染种间屏障的关系以及系统发生关系;【方法】利用DNAstar和Clustalx程序及treev32软件进行了22种偶蹄动物的43个完整PrP基因序列的同源性分析、多重排比和进化树构建;【结果】不同种属偶蹄动物的PrP基因完整ORF大小有所差异,范围为768～795 bp,可编码255～264个氨基酸的朊蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性,偶蹄动物间≥88.6%和≥93.3%,反刍动物间≥95.4%和≥96.5%。共发现40个点突变和2个突变区。在N-端柔韧无序"尾"区(25～135)以八肽重复缺失为主,球形结构域区(136～241)以点突变为主,点突变主要簇聚在S1 -折叠前的柔韧无规卷曲区的C-端部分和HC -螺旋内。氨基酸104～135区和球形结构域区存在有8个高突变位点。已知PrP肽基元和功能位点如芳烃回文序列基元、2个N-连接糖基化位点、2个苏氨酸磷酸化位点、1个酪氨酸硫化位点、形成二硫键的2个半胱氨酸以及GPI锚锚着点丝氨酸为偶蹄动物所共有,各种间变异体的各结构模式非常一致。进化关系分析,可将偶蹄动物PrP基因区分为3大类,反刍动物PrP基因分为3小类。令人意外的是,2个双峰驼PrP基因的进化关系与牛属动物基因同源。【结论】偶蹄动物的PrP基因是一个保守基因,氨基酸104～135区和球形结构域区内的8个高突变位点可能是影响分子间相互作用、形成朊粒病传染种间屏障的主要位点,物种间各氨基酸变异并不影响PrP的主要结构和功能。     

人、牛和羊叠朊基因的表达及牛叠朊蛋白抗血清的制备

叠朊（Dpl）是朊蛋白（PrP）的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a（4-）上,将重组表达载体转入E.coli BL21（DE3）pLys S,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS—PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E．coli中获得了高效表达。用Ni—NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West—blot分析表明,制备的牛Dpl抗血清与重组人、牛和羊的Dpl以及牛和羊睾丸组织的Dpl发生了特异性反应,却不与重组人、牛和羊的PrP发生反应。上述结果表明制备的Dpl抗血清可以作为人、牛和羊Dpl的检测试剂和研究材料。     

鸭血浆蛋白(酶)多态性电泳图谱及其与数量性状的关系

本试验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究了鸭不同品种、不同品系及其商品代等10个组合的血浆淀粉酶（Amylase）、酯酶（Esterase－1）、转铁蛋白（Transferrln）、前白蛋白（Prealbumin）等四项血浆蛋白（酶）的电泳图谱，发现淀粉酶、转铁蛋白、前白蛋白、酯醉（ES－1）强带的电泳图谱在品种间、品系间都没有差异；酯酶（ES－1）弱带型在不同品种间、及品系间具有统计上的差异，其遗传表达行为与性别有关。各品种间、及品系间的Tf相对含量、酯酶强带相对含量及其与鸭的各项肉用性能的关系无特定的趋向可盲。不同品种、不同品系间酯酶弱带图谱的统计上的差异与数量性状有关；ES－la型频数高的品种或品系，其生长速度快、饲料转化率高，ES－1b型频数高的两个不同专门化品系（指父系和母系）杂交后代的杂种优势率最大．ES－1e型频数以麻鸭类型品种为高。     

猪附红细胞体基因与蛋白研究进展

对猪附红细胞体病的流行分布与危害,猪附红细胞体基因与蛋白概况和主要基因与蛋白等方面进行了系统阐述,以期为猪附红细胞体功能基因与蛋白的深入研究和该病的有效防控提供参考。     

转真菌蛋白基因水稻生物学性状观察及抗病性鉴定

观察了转真菌蛋白基因水稻品种日本晴的再生植株及其种子苗的生物学性状,评价该品种对稻瘟病、纹枯病和白叶枯病的抗性。结果表明,转基因植株及其后代对3个病害的抗性水平均有明显提高。尤其是阳49号和阳26号植株及后代对3个病害均为中抗或抗。     

甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白基因的克隆与结构分析

 【目的】生物素羧基载体蛋白负责将羧基从生物素羧化酶转移到羧基转移酶上，对于长链脂肪酸的从头合成与种子含油量的形成具有十分重要的作用。本研究的目的是从甘蓝型油菜品种基因组DNA中分离生物素羧基载体蛋白（BCCP）基因的全长编码区序列，通过生物信息学分析揭示该基因的结构特征（包括内含子的数量、长度与分布，蛋白质保守区疏水性特征等）和功能关系。【方法】基因克隆采取同源序列法进行。【结果】分离得到的bccp基因全长均为1 600 bp左右，根据其结构特点可以分成3种类型，它们均包含5个内含子。bccp1基因编码的蛋白质具备完整的生物素化功能结构域，是唯一功能完整的基因序列；bccp2和bccp3由于移码突变造成蛋白合成提前终止，翻译的蛋白质均缺少生物素化结构域。【结论】本研究首次从中国冬油菜品种中克隆获得bccp基因的全长序列并揭示了其序列特征，为进一步利用该基因开展含油量的基因调控研究提供了科学依据。     

人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染

目的：构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．方法：以重组质粒pcDNA3．1／lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP—N1／lif．并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT—PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达．结果：成功构建融合表达载体pEGFP—N1／lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP—LIF．结论重组pEGFP—N1／lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白、为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．     

黑龙江省水稻主栽品种（系）抗瘟基因Pi15（t）例的SSR检测

用SSR分子标记RM316对黑龙江省45个水稻主栽品种（系）的抗稻瘟病基因用Pi15（t）进行检测。结果表明，检测到45个水稻主栽品种（系）有30个水稻品种（系）含有Pi15（t）抗瘟基因，明确了该基因在黑龙江省水稻主栽品种（系）中的分布情况，为抗稻瘟病品种的选育和利用提供了理论依据。     

工业大麻（ 汉麻） 组织培养的研究进展

大麻是重要的纤维、油料以及粮食作物。近年来,随着人们回归自然,更加重视环保和健康等理念,对工业大麻的特性有了深入的了解,世界各国对工业大麻资源的利用与开发越来越重视。据联合国粮农组织统计,目前世界上种植工业大麻的国家有27个。随着基因工程的快速发展,大麻组织培养技术被广泛的应用到大麻育种工作中,文中主要简述工业大麻（汉麻）组织培养技术的研究进展,为培育优良的大麻新品种奠定基础。     

绵羊LHβ基因多态性与繁殖性能的相关性

设计6对引物,采用PCR-SSCP技术检测促黄体素β基因(LHβ)5′调控区和外显子在高繁殖力绵羊品种(湖羊)和低繁殖力绵羊品种(陶赛特、特克赛尔和哈萨克)中的单核苷酸多态性(SNPs),并探讨该基因与湖羊繁殖力的关系。结果显示,在5′调控区发现4个多态性位点(286 bp T→C、424 bp A→G、439 bp T→C、705 bp G→A),在第2外显子区发现2个多态性位点(1 042 bp C→G、1 136 bp C→T),在第3外显子区内没有任何SNPs位点。研究初步表明,湖羊LHβ基因AB型的平均产羔数比AA型多0.45只(P0.05),GJ型的平均产羔数比GG型多1.83只(P0.05),EE型平均产羔数比EF型多0.03只,但差异不显著(P0.05);AB基因型初生重最小二乘均值比AA基因型多0.56 kg(P0.05),体高最小二乘均值比AA基因型多2.12 cm(P0.05);其他基因型的初生性状之间差异均不显著(P0.05)。     

北极狐GH基因的单核苷酸多态性及其与生长性状的关联性分析

以北极狐的生长激素基因(GH)作为候选基因,以大兴安岭图强林业局狐场提供的北极狐为试验群体,采用单链构象多态性(PCR-SSCP)和DNA测序的方法检测了GH基因单核苷酸多态性(SNPs),针对该群体的特点建立合适的统计分析模型,并进行了GH基因多态性与生长性状的相关分析。结果表明,在北极狐GH基因的外显子2、内含子2和外显子3上发现4个多态位点,分别为外显子2上的G81A突变、内含子2上的C186T和T239C突变,以及外显子3上的C583A突变;GH基因C583A多态性与公狐的体长性状显著相关(P0.05)。利用以上点突变对北极狐的体重及皮张长度性状进行标记辅助选择研究,可达到快速选育出优质北极狐的目的。     

海岛棉的一个富含亮氨酸重复受体蛋白基因的克隆和功能分析

通过染色体步移获得了海岛棉的一个受体蛋白基因Gb Vdr1,其开放阅读框为3 387个核苷酸,编码1 128个氨基酸,编码蛋白分子量为1.249×105,等电点为5.86。Gb Vdr1与陆地棉抗病材料常抗棉和感病材料渝棉1号中的同源基因Gh Vdr1和Gh Vdr1-1的相似度高达99.85%。Gbvdr1具有信号肽、跨膜区、LRR重复区、蛋白质降解相关的PEST结构域以及内吞信号。Gb Vdr1在根茎中的表达量高于叶片,其对非落叶型黄萎病菌株BP2的反应较落叶型菌株V991的更为强烈,并且这种差异在茎和根中更为明显。Gb Vdr1定位于细胞膜上。PCR鉴定共获得Gb Vdr1过表达转基因株系23株,对目的基因表达量最高的株系进行黄萎病抗性鉴定,结果表明转基因株系对BP2的抗性显著增强,但是对V991没有抗性。转基因株系接种黄萎病后防卫反应(PR)相关基因PR1、PR5、EDS1以及GST1的表达量较野生型显著增加。对于Gb Vdr1的功能分析结果表明其参与了棉花对BP2的抗性反应。     

影响鸡肌内脂肪的重要候选基因研究进展

心脏型脂肪酸结合蛋白（Heart fatty acid binding acid, H-FABP）、脂肪型脂肪酸结合蛋白（Adipocyte fatty acid binding protein, A-FABP）和细胞外脂肪酸结合蛋白（Extracellular fatty acid binding protein, Ex-FABP）对鸡肌内 脂肪性状的影响越来越引起研究者的关注。在总结、回顾近年来鸡肌内脂肪性状研究进展的基础上,从H-FABP、AFABP 、Ex-FABP 基因功能、基因单核苷酸多态性以及两基因聚合基因型效应等方面,详细介绍和阐述了其与肌内脂 肪含量的关系,并提出未来鸡肌内脂肪性状的3 个重要候选基因研究需要解决的问题,对鸡肌内脂肪性状的3 个重 要候选基因的研究进行综述,为优质鸡的遗传育种工作提供新的思路和突破口。     

钙蛋白酶抑制蛋白基因作为肉质候选基因的研究进展

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin CAST),是钙蛋白酶系统的成员之一,对畜禽肌肉的嫩度等肉质性状有调节作用。本文阐述CAST基因的结构特征、表达与定位、调节机理、多态性及其与肉质性状的相关研究进展。