降解2,4-二氯酚的假单胞菌GT241-1的特性及其3,5-二氯儿茶酚1,2-双加氧酶基因定位

从2,4-二氯酚生产厂排污口污泥中分离并筛选到一株降解2,4-二氯酚的细菌GT241-1，经鉴定属假单胞菌属。菌株GT241-1能在48h内将90mg/L的2,4-二氯酚降解91%。GC/MS分析表明，该菌株能将2,4-二氯酚彻底降解而不积累中间代谢产物。经38℃热处理，菌株GT241-1中有1.9%丧失了2,4-二氯酚降解能力。菌株GT241-1有两条大质粒带。Southern杂交表明，菌株GT241-1的3,5-二氯儿茶酚1，2-双加氧酶基因定位于约11kb的EcoRI/XbaI酶切片段。     

来源于Pseudomonas sp.1 7对硝基酚降解基因簇中的对苯二醌还原酶基因的克隆和功能鉴定

Pseudomonas sp. 1 7 可以利用对硝基酚（PNP）作为唯一的碳源,氮源和能源生长。为了鉴定菌株1 7代谢PNP的相关基因,本研究构建了菌株1 7基因组的Fosmid文库,并通过文库的筛选克隆得到一段长为12.3 kb的基因簇序列。序列分析显示,该基因簇中共有7个基因（pdcEDGFCBA）与PNP的代谢相关。其中PdcB与来源于Pseudomonas sp. WBC 3中的对苯二醌还原酶（PnpB）有98%的相似性。将pdcB基因在E. coli BL21中过量表达,并通过Ni NTA亲和层析纯化重组蛋白PdcB。体外的酶活测定表明,PdcB为一个FAD和NADH依赖型的对苯二醌还原酶,能够催化对苯二醌降解并生成对苯二酚。     

施氏假单胞菌YC-YH1对甲基对硫磷的降解及其代谢产物检测

利用实验室已获取的菌株YC-YH1对甲基对硫磷进行降解,以高效液相色谱结合质谱分析(HPLC-MS)测定菌株YC-YH1对甲基对硫磷的降解速率并检测其代谢产物,通过基因克隆研究菌株YC-YH1对甲基对硫磷降解的分子机制,同时分析代谢产物对菌株YC-YH1生长的影响.结果表明,菌株YC-YH1为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),能够高效降解甲基对硫磷,其同时含有甲基对硫磷水解酶基因mpd和有机磷水解酶基因ophC2.经质谱分析确定,菌株YC-YH1将甲基对硫磷水解为对硝基苯酚和二甲基硫代硫酸酯,其中对硝基苯酚显著抑制YC-YH1的生长.综上,施氏假单胞菌YC-YH1能够高效地降解甲基对硫磷,但对硝基苯酚作为其代谢产物对YC-YH1的生长存在显著抑制作用.     

节杆菌与施氏假单胞菌对甲基对硫磷的共降解研究

为实现对有机磷农药甲基对硫磷的彻底降解,研究利用有机磷农药降解菌施氏假单胞菌YC-YH1与对硝基苯酚降解菌CN2对甲基对硫磷进行共降解试验,同时克隆了参与降解过程的相关基因,并对2株菌株在对甲基对硫磷污染土壤的原位修复中的效果进行研究。结果表明,与YC-YH1单独降解相比,YC-YH1和CN2共降解在处理前32 h无较大差异;但之后,甲基对硫磷和对硝基苯酚的降解速度明显加快,处理48 h后甲基对硫磷即被完全降解,比单独用YC-H1降解时提前了16 h,处理64 h时对硝基苯酚就被完全降解。而土壤修复的研究结果表明,菌株YC-YH1与CN2能够高效降解甲基对硫磷,72 h对土壤中100 mg/kg甲基对硫磷的降解率接近100%,尤以未灭菌土壤中降解效果更好。     

沼泽红假单胞菌的选育及对酚降解性能探讨

分别用紫外线、N＋离子束和硫酸二乙酯作为诱变剂,对沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonaspalustris进行单因素诱变和复合诱变,筛选高效降酚菌株。结果表明,在单因素诱变中,N＋离子注入后的突变株,生长速率加快,脱氢酶活性较对照菌提高14.89%,该提高率是紫外诱变株和化学诱变株的2倍。复合诱变菌株菌落颜色明显加深,其生长速率和脱氢酶活性均比单因素诱变菌大。在以苯酚作为唯一碳源的培养基上,单因素诱变菌株和复合诱变菌株对酚均有较好的降解能力,其中复合诱变菌株在含酚2000mg·L^-1的培养基中降解培养72h,对酚的去除率达94%,对高浓度含酚工业废水的酚降解率达81.20%,降解效果均显著好于单因素诱变菌,说明N＋离子注入诱变是筛选沼泽红假单胞菌更有效的方法,复合诱变使沼泽红假单胞菌获得了更多的优良性状,其突变株的环境适应能力比单独诱变的好。     

固氮施氏假单胞菌电子传递复合体rnf基因簇的功能鉴定

能量供应是限制生物固氮效率的重要因素,电子传递复合体是生物固氮过程中能量产生的重要组成部分。基因组分析表明,在联合固氮菌施氏假单胞菌A1501基因组中存在两套编码电子传递复合体rnf,分别为基因簇rnf1和rnf2,其中rnf1位于固氮基因岛上,rnf2基因簇位于核心基因组上。为了明确两套电子传递体在生物固氮过程中的功能,分别构建了rnf1和rnf2基因簇的突变株并测定了相关表型。结果发现,在基本培养基中两个基因簇的突变都不影响菌体生长,可能相互之间存在着功能互补;固氮酶活性测定结果表明,位于固氮基因岛中的rnf1基因簇缺失造成固氮酶活下降80%以上,而rnf2基因簇的缺失对酶活无显著影响。进一步采用启动子-lacZ融合表达策略探究了基因簇rnf1对固氮酶结构基因nifH转录的影响,发现rnf1极性突变株中nifH的启动子转录活性仅为野生型的17.59%,推测rnf1缺失造成了固氮条件下能量产生匮乏,胞内碳氮比失衡,进而造成固氮系统表达受抑制。     

萘降解菌的分离、鉴定及降解途径

从武汉市金口张公堤处污泥富集分离出2株能以萘为唯一碳源生长的优势降解菌株XA1和XB1,经形态学观察、生理生化鉴定及16SrDNA测序分析,确定它们属于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。其最适生长温度均为28℃,最适生长pH分别为7.5和7.0。在最适生长条件下,菌株XA1、XB1以3%的接种量对500mg/L萘的降解率在第3天时分别达到了93.4%和74.7%。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测到XA1、XB1中有儿茶酚2,3-双加氧酶基因(nahH)等萘降解过程中的关键酶基因,与NCBI中发布的基因序列相比较,相似度均达到99%。     

2,4-二氯酚降解细菌菌株对含2,4-二氯酚废水的好氧处理

从土壤中分离到两株能以2,4-二氯酚为唯一碳源和能源生长的、具有降解2,4-二氯酚能力的细菌GT241-1和GT141-2,鉴定后确定它们是假单胞菌属(Pseudomonas sp.). 菌株GT241-1和菌株GT141-2在最适温度25～30 ℃下,能将60～100 mg/L的2,4-二氯酚分别降解到8～12 mg/L和25～30 mg/L. 经驯化的活性污泥在投加污泥总量0.59%和1.18%(以干重计)的假单胞菌GT241-1菌体后,对含2,4-二氯酚60 mg/L和COD 1500 mg/L的模拟废水分批处理20 h左右后可使2,4-二氯酚含量降到最低值9 mg/L,与未投加GT241-1菌体的对照相比它们对2,4-二氯酚降解速度较快. 用活性污泥法对含2,4-二氯酚废水进行连续处理时, 投加GT241-1菌体可加快反应器的起动; 反应器以2,4-二氯酚浓度60 mg/L、HRT 20 h通入模拟废水运行时, 投加GT241-1菌体者与未投加菌体的对照的出水中2,4-二氯酚含量分别为11.2 mg/L和16.7 mg/L, 前者对2,4-二氯酚的处理效果较好.     

6-磷酸果糖激酶基因pfkA在施氏假单胞菌中的异源表达及其表型分析

糖代谢在生命活动中具有重要意义,它保证了生物体生命活动所需的物质和能量的供应。葡萄糖作为自然界中普遍存在的最简单的单糖,是生物体的理想碳源。施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501具有广泛的、典型的微生物代谢途径,但是该菌利用葡萄糖的效率很低。基因组分析表明A1501菌缺少糖酵解（EMP）途径中编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA,初步认为这可能是A1501菌不能高效利用葡萄糖的原因。利用穿梭质粒pLAFR3将大肠杆菌的pfkA基因导入到施氏假单胞菌中,通过pfkA基因的异源表达重建A1501菌的EMP途径。测定了重组菌株的糖类代谢能力,结果表明pfkA基因的导入并没有赋予重组施氏假单胞菌更强的葡萄糖及其他糖类的利用能力,说明A1501菌葡萄糖利用的低效率除了缺乏pfkA外,还有其他的因素。研究也发现,导入pfkA的重组施氏假单胞菌对H2O2高度敏感,推测pfkA导入重建后的EMP途径可能影响了该菌的还原力合成,导致菌体对氧化胁迫的耐受能力降低。     

一株栖稻假单胞菌NYCS1-5的鉴定及其对玉米的耐盐促生功能

本试验针对实验室前期保藏的菌株NYCS1-5进行了细胞和菌落形态鉴定、生理生化分析、耐盐促生功能研究、16S rDNA系统发育树分析,鉴定此菌株为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)。经研究,栖稻假单胞菌NYCS1-5同时具备较强的解磷和溶磷能力,也具有一定的解钾能力和产IAA的功能,该菌耐盐范围可达7%。通过玉米营养液培养实验也研究了菌株NYCS1-5对玉米在有盐(100 mmol/L Na Cl)、无盐条件下的促生功能,记录玉米在生长第4、10和12 d的株高和根长生长状况。在有盐条件下,玉米生长10 d时,菌株NYCS1-5处理组的玉米生理株高和根长分别提高了21.36%和16.64%,均达到显著性差异,菌株NYCS1-5表现出对玉米的耐盐促生功能。在无盐条件下,菌株NYCS1-5对玉米生理株高及根长也表现出了一定的促进作用;玉米生长12 d时,菌株NYCS1-5处理组的玉米生理株高增加了17.38%,达到显著差异。因此,此栖稻假单胞菌NYCS1-5对玉米等作物有耐盐促生应用价值。     

来源于云斑天牛肠道细菌Pseudomonas sp. TN06的β-折叠桶植酸酶基因phyA06的克隆、表达和酶学性质研究

从云斑天牛肠道中筛选到一株产植酸酶活性较高的假单胞菌Pseudomonas sp.TN06。采用简并PCR和TAIL-PCR的方法获得一个新的β-折叠桶植酸酶基因(phyA06),开放阅读框全长1 902 bp,编码633个氨基酸和1个终止密码子,预测其前23个氨基酸为信号肽,含有两个β-折叠桶结构域。将phyA06基因在大肠杆菌中表达,重组蛋白经镍柱纯化后达到电泳纯。纯化后的重组酶最适pH为7.0,在pH 6.0~10.0的条件下具有很好的稳定性;最适温度为55℃,热稳定性良好。同时,该酶在低温下仍保持一定活力,甚至0℃仍有活性。该植酸酶具有应用于水产饲料行业的潜在价值。     

鞘氨醇胞菌B1咔唑降解基因carB的克隆与功能研究

以分离到的咔唑高效降解菌鞘氨醇胞菌B1为材料,研究该菌株咔唑降解基因簇的组成和表达模式,阐释咔唑降解过程中关键酶的作用机理。通过分析不同菌株咔唑降解基因簇中基因的保守区,从菌株B1中成功克隆得到基因簇中carAa、carBa、carBb和carC基因片段。通过RT-PCR证实菌株B1的咔唑降解基因簇为诱导表达。通过同源克隆得到降解关键基因carB和编码两个亚基的carBa、carBb基因,并在大肠杆菌中进行了异源表达。以2,3-二羟基联苯为底物,对CarB粗酶液进行了酶学性质分析。研究表明CarB蛋白催化最适pH和温度分别为7.4和30℃,Fe2+能显著提高酶的催化活力。     

脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp. A15木聚糖酶基因xynA15的克隆表达及性质研究

从云南保山市的一眼温泉中分离到一株嗜热嗜酸菌,脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.A15。通过同源克隆和TAIL-PCR方法,从该菌株中克隆得到一个木聚糖酶基因,xynA15,全长990 bp,编码329个氨基酸和一个终止密码子。将xynA15基因克隆到原核表达载体pET-22b(＋)上,并转化至BL21(DE3),经过IPTG诱导,其表达产物具有木聚糖酶的活性。对其酶学性质研究发现,XynA15的最适温度为50℃,最适pH值为70,不仅在较广的温度范围（35℃~60℃）内具有较高的酶活,而且在50℃具有较好的热稳定性。     

来源于青霉Penicillium sp. C6的β-1,3(4)-葡聚糖酶基因的克隆及酶学性质分析

从青霉Penicillium sp. C6菌株基因组DNA中克隆到一个新的16家族的葡聚糖酶基因,命名为bglc6(GenBank登录号:JX854434)。其cDNA全长为1 044 bp,包含N端前20个氨基酸的信号肽序列和一个16家族的结构催化域。bglc6编码的氨基酸序列与Grosmannia clavigera kw1407的假设葡聚糖酶蛋白序列最高一致性为64%。成熟蛋白BglC6在毕赤酵母中已成功表达,酶学性质分析表明,BglC6最适pH为4.5,最适温度为50℃,在酸性范围内具有良好的稳定性。以大麦葡聚糖酶为底物时,BglC6的比活、Km及Vmax值分别为253.8 U/mg,8.42 mg/mL,478.4 μmol/min·mg。蛋白BglC6对大多数金属离子有较好的抵抗能力。因此,该葡聚糖酶在动物饲料行业领域中具有潜在的应用前景。     

Cloning and Sequence Analysis of a Novel Cold-Adapted Lipase Gene from Strain Iip35 (Pseudomonas sp.)

A combination method of the usual-PCR and reverse-PCR for the cloning of a novel lipase gene directly from the total genomic DNA of strain lip35 (Pseudomonas sp.) is described, whereby a lipase gene (lip) was cloned directly from genomic DNA. The sequence data have been deposited in the GenBank and EMBL data bank with the accession number EU414288. The nucleotide sequence showed a major open reading frame encoding a 59-kDa protein of 566 amino acid residues, which contained a lipase consensus sequence GXSXG. The lipase lip had 74 and 70% homologies with the Upases of an uncultured bacterium and P.fluorescens PfO-1, respectively, but it did not show any overall homology with lipases from other origins. The functional lipase was obtained when the lip gene was expressed in Pichia pastoris GS115.     

链霉菌Streptomyces sp. S9木聚糖酶基因xynBS9的克隆表达及性质分析

通过设计简并引物和构建基因组文库的方法从链霉菌Streptomyces sp.S9中克隆得到β-l,4-木聚糖酶基因xynBS9。该基因全长1 023 bp,编码340个氨基酸。将不带原基因信号肽编码序列的xynBS9以正确阅读框架克隆到表达载体pET-22b(+)上,并在大肠杆菌BL2l(DE3)中诱导表达。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和疏水柱纯化后达到电泳纯。酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为60℃,最适pH为6.5,在碱性条件下具有良好的稳定性。     

苯胺降解菌Rhodococcus sp. E2的分离与苯胺氧化酶基因簇的初步鉴定

从江苏省南通市某农药厂的活性污泥中分离出一株苯胺降解菌株E2,根据表型特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,将其鉴定为红球菌属(Rhodococcus sp.)的细菌。菌株E2降解苯胺的最适温度为30℃、最适pH为7.0,降解苯胺的最高浓度为800 mg·L-1。该菌能降解苯胺、邻甲基苯胺、对甲基苯胺和2,5-二氯苯胺,与已报道的苯胺降解菌的底物谱显著不同。通过扩增高度保守的片段和染色体步移,获得了菌株E2中负责苯胺降解的基因簇,该基因簇在基因组成、排布及同源性方面和已报道的基因簇有较大差异,是研究苯胺降解分子机理的较好材料。     

谷关假单胞菌脂肪酶基因PgLip1的克隆和表达

低温脂肪酶在饲料、洗涤、有机合成等行业中具有重要的应用价值,然而目前已发现的低温脂肪酶数量不多,对其基因多样性了解不够深入,因此有必要从自然环境中挖掘新的低温脂肪酶基因。为了获得低温脂肪酶基因资源,通过基因组序列比对分析,从谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）中发现并克隆获得一个脂肪酶基因P. guguanensis lipase 1 (PgLip1),并对该基因进行序列分析和蛋白质预测,表达后检测PgLip1的最适底物、最适pH、最适温度,同时研究了表面活性剂、变性剂、EDTA、金属离子及有机溶剂对该酶活性的影响。结果显示：该基因片段大小为840 bp,预测编码含279个氨基酸残基的蛋白质,氨基酸序列与来源于门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）的脂肪酶相似性92.6%。该酶的最适温度为10 ℃,在0 ℃相对酶活为60.2%,是一个低温脂肪酶;其最适pH为8.5,在pH 3.0~12.0时,仍然具有62%以上的相对酶活。40 ℃处理45 min后,PgLip1还能保持72.6%的残余酶活。该酶的最适反应底物为对硝基苯基丁酸酯(pNPB);在高浓度异丙醇、异戊醇和乙酸乙酯中的酶活反而高于相应较低浓度中,吐温-20、吐温-80和Triton X-100表面活性剂能较大程度激活PgLip1（3.2~5.9倍）。研究丰富了对低温脂肪酶生物多样性的科学认识,所获得的PgLip1是一个受表面活性剂特异激活且对部分高浓度有机溶剂耐受的低温脂肪酶,具有较好的应用前景。     

马铃薯蛋白激酶基因StPK1启动子的克隆及活性分析

 【目的】研究马铃薯蛋白激酶基因StPK1,为在马铃薯抗病反应中的功能提供证据。【方法】利用 TAIL-PCR技术,从马铃薯晚疫病水平抗性、垂直抗性和感病等3种材料中,分别克隆了该基因的启动子区域。此外,将从水平抗性材料中克隆得到的启动子与GUS连接构建植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),将得到的转基因烟草分别用水、晚疫病原菌或水杨酸(SA)溶液处理,并进行表达活性分析。【结果】3个启动子长度分别为922、929和922 bp,均具有TATA-box和CAAT-box以及多种与抗病反应和基因时空表达有关的元件,而三者的主要差异是个别碱基的不同。GUS组织化学染色表明,用晚疫病原菌或SA处理的转基因烟草被染成蓝色。【结论】StPK1启动子为有活性的启动子,且为病原和SA诱导型启动子。