干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P<0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P0.05;P0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素(MSTN)对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖(DCN)为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2(si-DCN)转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期(GM)牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天(DM3)的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),且EdU阳性细胞率显著增加(P<0.05),表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组(P<0.01;P<0.05),MyHC在mRNA水平显著降低(P<0.05),但在蛋白水平上极显著升高(P<0.01),免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组(P<0.05),说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

干扰UBE2N对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为了探究泛素结合酶2N(ubiquitin-conjugating enzyme 2N, UBE2N)对牛骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells, MSCs)增殖和分化的影响,试验采用天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室冻存的牛MSCs建立成肌分化模型,设计UBE2N的siRNA(si-UBE2N)构建UBE2N的干扰模型,转染牛MSCs,并以转染si-NC作为对照;采用qRT-PCR和Western-blot方法分别检测转染后对UBE2N基因和蛋白表达的干扰效果;采用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测si-UBE2N对牛MSCs增殖的影响;在荧光倒置显微镜下观察分化期(DM期)牛MSCs的肌管形成状态,通过qRT-PCR和Western-blot方法分别检测MSCs中肌细胞生成素(MyoG)和肌球重链蛋白(MyHC)基因和蛋白表达水平,分析转染si-UBE2N对牛MSCs分化的影响。结果表明：与对照组相比,转染si-UBE2N后UBE2N基因和蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。干扰UBE2N后经EdU染色发现,牛...     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素（MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖（DCN）为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2（si-DCN）转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期（GM）牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天（DM3）的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调（P<0.05;P<0.01）,且EdU阳性细胞率显著增加（P<0.05）,表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,MyHC在mRNA水平显著降低（P<0.05）,但在蛋白水平上极显著升高（P<0.01）,免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组（P<0.05）,说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

【目的】 探究对牛骨骼肌发育具有调控作用的长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）,研究其在牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期的表达量变化,为牛肌肉发育相关机制方面的研究提供参考依据。【方法】 选取实验室前期高通量测序获得的1条lncRNA （lnc721）,通过NCBI数据库和CPC网站分析其生物学信息并预测其编码能力,通过核质分离试验确定其亚细胞定位。设计并合成lnc721的siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞,通过成熟的体外成肌细胞诱导分化模型培养牛骨骼肌卫星细胞并进行诱导分化。分别采用EdU试验、实时荧光定量PCR和Western blotting分析lnc721在细胞发育不同时期表达量的变化情况。【结果】 lnc721位于牛全基因组的18号染色体上,其蛋白编码能力为―1.33129,主要定位于细胞质内。在干扰lnc721表达量后发现,EdU阳性细胞比率极显著上升,细胞增殖标志因子Pax7和Ki-67基因的mRNA表达水平极显著上调（P<0.01）;Western blotting结果进一步证明,干扰lnc721后极显著促进了Pax7蛋白的表达（P<0.01）,在细胞分化期干扰lnc721表达后,细胞分化标志因子MyHC基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著下调（P<0.01）。【结论】 干扰lnc721表达可促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖并抑制成肌分化进程。     

miR-374b及其靶基因Myf6调控成肌细胞增殖分化的研究

本实验旨在研究miR-374b及其靶基因Myf6调控肌细胞增殖分化的作用机制。首先采集70日龄胎羊,培养成肌细胞并诱导分化成肌管,通过荧光定量PCR测定诱导分化时期(0、24、72、120 h)miR-374b、Myf6基因以及成肌细胞增殖标志基因MyoD和分化标志基因MyoG、MyHC在mRNA水平的表达量;通过转染miR-374b过表达载体(mimics)及抑制载体(inhibitor),研究各基因在细胞中mRNA水平的表达规律;采用蛋白免疫印迹技术检测Myf6基因在细胞中蛋白水平表达变化规律。结果表明:细胞在分化第72、120小时出现大量肌管,诱导分化成功;miR-374b的表达趋势为先上升后下降,细胞增殖标志基因MyoD在细胞增殖期(0 h)表达量较高;分化标志基因MyHC、MyoG及Myf6基因在细胞增殖期表达量较低,进入分化阶段后表达量极显著上调;转染miR-374b过表达载体(mimics)后,miR-374b表达量极显著高于阴性对照组,而Myf6基因、MyHC基因表达量极显著低于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著低于阴性对照组;转染miR-374b抑制载体(inhibitor)后,miR-374b表达量极显著低于阴性对照组,而Myf6、MyHC、MyoD基因表达量极显著高于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著高于阴性对照组;MyoG基因表达量显著低于阴性对照组。上述结果表明,miR-374b可能通过靶向Myf6基因抑制绵羊成肌细胞分化。     

层粘连蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

本研究主要探讨细胞外基质主要蛋白成分层粘连蛋白(LN)对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。利用原代牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,用LN作为组织培养皿的表面涂层模拟肌肉细胞外基质,通过EdU细胞增殖检测技术检测传代后增殖12～24 h期间细胞生长状态最佳时的增殖情况,用实时定量qRTPCR和Western blot检测成肌分化标志基因表达情况。结果表明:与对照组相比,LN处理组EdU阳性细胞数无显著差异;在LN涂层上培养的肌卫星细胞的增殖标志基因Pax7在增殖12、24 h也均无显著差异;与对照组相比,在LN涂层上培养的肌卫星细胞分化标志基因MyHC在分化12 h时mRNA表达水平上极显著上调,分化48 h时蛋白表达水平极显著上调。本研究证实外源性LN铺板提前了体外培养牛骨骼肌卫星细胞的分化进程,具有促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的作用。     

干扰HNRNPAB对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的作用研究

为了研究核不均一核糖核蛋白AB(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB, HNRNPAB)对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响。本研究以体外分离培养的鲁西黄牛胎牛原代骨骼肌卫星细胞为试验材料,体外诱导成肌分化,分别收取分化前和分化后第1、2、3天的细胞,提取RNA(每组设置4个重复)或蛋白质(每组设置3个重复),通过qRT-PCR、Western blot检测HNRNPAB在成肌分化前后的表达情况。随后合成HNRNPAB的干扰RNA,并转染牛骨骼肌卫星细胞干扰HNRNPAB的表达,设置阴性对照组;在试验组和对照组中,分别利用EdU试验检测细胞增殖情况,qRT-PCR技术、Western blot技术检测HNRNPAB、增殖标志因子Pax7、Cyclin D1及分化标志因子MyoG、MyHC的mRNA表达水平及蛋白表达水平。结果显示,HNRNPAB在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中的mRNA表达呈现先升后降的趋势,在分化第1天表达量最高,分化前后蛋白表达水平也具有显著差异。干扰HNRNPAB后,EdU细胞阳性率极显著上升(P<0.01),增...     

长链非编码RNA MSTRG.14200对猪骨骼肌卫星细胞分化及肌纤维转化的影响

【目的】探究长链非编码RNA(lncRNA)MSTRG.14200对猪骨骼肌卫星细胞(PSCs)成肌分化及不同类型肌纤维转化的影响。【方法】选择3头6月龄杜洛克猪,屠宰后采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、背最长肌、腿肌、比目鱼肌和趾长伸肌组织,利用实时荧光定量PCR检测MSTRG.14200在不同组织中的表达情况。构建MSTRG.14200过表达载体pcDNA3.1-14200并转染PSCs细胞,诱导分化3 d后收集细胞。通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测肌球蛋白重链(MyHC)、肌细胞生成素(MyoG)和肌分化因子(MyoD)、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx mRNA和蛋白表达情况;利用免疫荧光法检测MyHC、MyHCⅠ和MyHCⅡb阳性细胞比率。【结果】MSTRG.14200在杜洛克猪不同组织中均有表达,且在背最长肌中表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),在趾长伸肌和比目鱼肌中的表达量存在显著差异(P<0.05)。过表达MSTRG.14200后,细胞分化相关基因MyoD和MyHC的mRNA水平极显著升高(...     

miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响

为了探究miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响,试验通过NCBI和Ensembl数据库分析整合miR-16a的位置及信息,用miR-16a mimics转染牛肌卫星细胞,将牛肌卫星细胞分为试验组(miR-16a mimics)和对照组(NC),采用实时荧光定量PCR扩增、Western-blot检测和EdU细胞增殖试验对转染处理后的牛肌卫星细胞的增殖和分化两个时期进行研究。结果表明：miR-16a位于牛12号染色体的反义链上,并由前体bta-miR-16a的5′端加工生成成熟的miR-16a。在增殖期,与对照组比较,试验组增殖标志因子Pax7 mRNA和其蛋白相对表达量显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01),EdU标记指数显著降低(P<0.05)。在分化期,与对照组比较,试验组分化标志因子MyoG mRNA相对表达量极显著下调(P<0.01)。说明miR-16a对牛肌卫星细胞的增殖和分化均存在抑制作用。     

FGF10基因调节山羊成肌细胞分化相关基因表达的研究

为了阐明FGF10基因对山羊成肌细胞分化的影响,试验以简州大耳山羊羔羊的成肌细胞为研究对象,体外培养并诱导分化为肌管,采用实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因在诱导分化过程中的表达水平;同时采用腺病毒过表达和SiRNA干扰技术、形态学观察和实时荧光定量PCR技术检测FGF10基因功能获得和缺失对成肌细胞中肌管形成的影响,以及分化相关基因MyoD1、Myf5、Myf6、MyoG的表达情况。结果表明:成肌细胞在分化第2～4天时,出现大量肌管,诱导分化成功。FGF10基因随着成肌细胞分化时间的延长呈现先升高后下降的趋势,且在诱导分化第2天时极显著高于分化前(P<0.01)。过表达FGF10基因时成肌细胞中的肌管形成减少,极显著下调MyoD1(P<0.01)和显著下调Myf5(P<0.05)基因的相对表达水平;而干扰FGF10基因时成肌细胞中的肌管形成增加,极显著上调MyoG(P<0.01)和显著上调Myf5(P<0.05)基因的相对表达水平。说明FGF10基因可能是山羊成肌细胞分化的负调控因子。     

miR-21在鸭胚胎期胸肌发育中的功能研究

旨在通过研究鸭miR-21的分子特征、时空表达模式以及对鸭骨骼肌卫星细胞的增殖与分化的影响,为探索骨骼肌发育机制提供支撑。本研究选取180枚(98±5)g鸭蛋,相同条件孵化。从孵化第11天到第27天每天取3枚鸭蛋(分别表示为:E11、E12、E13……E26、E27),无菌状态下逐只采集鸭胚胸肌样品。E27时另取3只鸭胚逐只采集腿肌、心、肝、肾、肌胃、小肠、腹脂和皮脂。混合酶消化法和差速贴壁法分离和纯化骨骼肌卫星细胞,骨骼肌卫星细胞增殖、分化时期分别过表达和干扰miR-21表达,利用荧光定量、蛋白杂交、EdU检测及流式细胞术等检测miR-21对鸭骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。qRT-PCR结果显示,miR-21的表达随着孵化时间的增加而增加,E19天时到达最高,然后逐渐降低;E27时,miR-21在肝中的表达量最高。在增殖的鸭骨骼肌卫星细胞中过表达miR-21,荧光定量PCR检测CDK2和CyclinD1基因的mRNA表达量分别显著(P<0.05)和极显著增加(P<0.01),EdU检测阳性细胞数目显著增加(P<0.05),流式细胞仪检测发现G2期细胞数目极显著降低(P<0.01)、S期细胞数量显著增加(P<0.05)。在增殖的骨骼肌卫星细胞中,干扰miR-21表达,所得结果相反。在分化的鸭骨骼肌卫星细胞中过表达miR-21,qRT-PCR检测MyoG和MyHC基因的mRNA表达量均极显著增加(P<0.01);蛋白杂交(WB)检测结果显示,MyoG蛋白表达显著增加(P<0.05),MyHC蛋白表达极显著增加(P<0.01)。免疫荧光检测发现,MyHC阳性细胞数和10核以上的肌管数都极显著增加(P<0.01)。在分化的鸭骨骼肌卫星细胞中,干扰miR-21的表达,所得结果相反。结果表明,miR-21具有促进成肌细胞鸭骨骼肌卫星细胞增殖和分化的作用。     

干扰Mtmr3基因对C2C12细胞增殖与分化的影响

旨在探究肌管相关蛋白3(myotubularin related protein 3,Mtmr3)对C2C12细胞增殖与分化的调控作用及机制。本试验以小鼠成肌细胞系(C2C12)为试验材料，分别使用qRT-PCR和免疫荧光染色检测Mtmr3基因在成肌细胞生长期与分化期的mRNA表达水平和分化第6天时的分布形态。合成Mtmr3的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),试验分为siRNA NC对照组和Mtmr3 siRNA处理组(n=3),利用EdU、CCK-8、qRT-PCR、Western blot技术检测Mtmr3 siRNA对成肌细胞增殖与分化的影响，并通过信号通路研究调控成肌细胞增殖与分化的机制。结果显示，Mtmr3在生长期的mRNA水平表达量总体呈下降趋势，而在分化期的表达量呈逐渐上升趋势，Mtmr3免疫荧光染色呈肌管状。干扰Mtmr3后，细胞内Mtmr3基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著地降低(P<0.01);在增殖试验中，转染细胞Mtmr3 siRNA后，极显著地增加了EdU阳性细胞占总细胞的比率和细胞活力(P<0.01);干扰...     

干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响

旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。     

METTL21C下调对小鼠成肌细胞分化的影响

为探究甲基转移酶样21C(methyltransferase like 21C,METTL21C)在小鼠成肌细胞分化过程中的功能,设计2组METTL21C的shRNA干扰序列,构建靶向METTL21C的干扰载体。用慢病毒法侵染小鼠C2C12细胞,筛选获得稳定干扰METTL21C的C2C12细胞株并检测干扰效率,经过20 mL/L马血清诱导细胞分化后用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测成肌分化相关基因表达。结果表明,成功构建两组靶向METTL21C的慢病毒干扰载体,实时荧光定量PCR及Western blot结果显示干扰组细胞中METTL21C表达水平均极显著降低(P0.01),shRNA1组干扰效率最高(73.6%)。干扰组细胞中成肌分化标志基因MyoG、MyoD、Myf5、MRF4表达水平均极显著降低,MEF2C表达水平下调更为明显(P0.01)。慢肌标志基因MYH7表达水平也极显著降低(P0.01)。说明METTL21C促进小鼠成肌细胞分化,其通过调控MEF2的表达影响MRFS家族基因从而影响成肌分化。     

RNA甲基化转移酶METTL3对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells, BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因...     

m6A去甲基化酶FTO对猪肌卫星细胞分化的影响

【目的】探究N⁶-甲基腺苷(m⁶A)去甲基化酶FTO表达水平对猪肌卫星细胞分化的影响,并比较不同表型猪FTO表达和m⁶A甲基化修饰水平。【方法】收集分化第0、2和4天的猪肌卫星细胞,用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测FTO和肌球蛋白重链(MyHC)蛋白表达、肌分化因子(MyoD)和肌细胞生成素(MyoG)的mRNA表达水平;利用免疫荧光法检测肌卫星细胞分化标志基因MyHC表达情况;采用Dot blotting检测m⁶A甲基化修饰水平。将过表达载体(OE-FTO)、空白对照(NC)和FTO基因干扰载体(siRNA-FTO)、阴性对照(siRNA-NC)分别转染猪肌卫星细胞并诱导分化,检测FTO、肌细胞分化相关基因表达情况以及m⁶A甲基化修饰水平,利用免疫荧光法检测MyHC表达以及肌管形成情况;利用Western blotting和Dot blotting分别检测大白猪、宁乡猪不同组织中FTO蛋白表达情况以及m⁶A甲基化修饰水平。【...     

circRNA-Zfp609对C2C12成肌细胞增殖和分化的影响

【目的】试验旨在探究circRNA-Zfp609调节C2C12成肌细胞增殖和分化的潜在分子机制。【方法】利用RT-PCR和测序分析小鼠骨骼肌组织和C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、骨骼肌组织及增殖12、24、36、48 h和分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的相对表达量;实时荧光定量PCR检测分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中肌细胞生成素（MyoG）和肌球蛋白重链（MyHC）的相对表达量。用circRNA-Zfp609的干扰表达载体（siRNA）干扰细胞,通过CCK-8测定siRNA对C2C12成肌细胞增殖率的影响;用实时荧光定量PCR检测siRNA干扰对circRNA-Zfp609、MyoG和MyHC相对表达量的影响。通过TargetScan 7.0和miRDB软件预测circRNA-Zfp609上与肌肉分化相关的miRNA位点,将筛选的miRNAs的过表达载体转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609与miRNA的互作关系。根据miRNAs对circRNA-Zfp609的互作,构建circRNA-Zfp609的野生型和突变型载体并转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609对miRNA的靶向关系。【结果】PCR和测序结果表明,小鼠骨骼肌中可表达circRNA-Zfp609;circRNA-Zfp609在小鼠骨骼肌中表达水平最高,在其他组织中的表达量由高到低依次是肾脏、肺脏、心脏、肝脏、胃、脾脏和小肠。与12 h相比,在C2C12成肌细胞增殖的36和48 h circRNA-Zfp609的相对表达量显著增加（P<0.05）;与分化第0天相比,在C2C12成肌细胞分化的第1、3和5天circRNA-Zfp609的相对表达量均显著增加（P<0.05）,MyoG、MyHC的相对表达量均极显著增加（P<0.01）。与NC组相比,siRNA组C2C12成肌细胞的增殖率和circRNA-Zfp609相对表达量均极显著降低（P<0.01）,MyoG和MyHC的相对表达量显著降低（P<0.05）。circRNA-Zfp609上有miR-150-5p、miR-327、miR-344g-3p和miR-615-5p 4种与肌肉分化相关的miRNAs。circRNA-Zfp609与miR-615-5p的吸附能力最强,具有靶向结合作用。circRNA-Zfp609可以作为分子海绵与调控肌肉分化相关的miR-615-5p相互作用。【结论】circRNA-Zfp609在小鼠的组织中广泛表达,在骨骼肌中表达水平最高;circRNA-Zfp609在C2C12成肌细胞增殖和分化的不同时期差异表达,circRNA-Zfp609上有4个与肌肉分化相关的miRNAs,其中miR-615-5p与circRNA-Zfp609具有靶向关系。本研究结果可为与家畜骨骼肌生长发育相关的研究提供参考。