禽腺病毒血清4型TaqMan 荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的Hexon基因设计1对特异性引物和探针,经反应条件优化,建立了荧光定量PCR检测方法。结果显示:以重组质粒为标准品建立的标准曲线在7.3×10~3拷贝/μL～7.3×10~8拷贝/μL具有良好的线性关系;该方法仅对FAdV-4扩增呈阳性,对NDV、AIV、IBV、IBDV、ILTV、FPV、FAdV-8a、FAdV-8b的检测均为阴性;对FAdV-4最小检出的梯度为7.3×10~1拷贝/μL,灵敏度为普通PCR的100倍;批内和批间重复试验的变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测,表明该方法的检出率比普通PCR方法高10%,可用于FAdV-4的快速诊断和定量分析。     

禽腺病毒4型PCR检测方法的建立与应用

根据禽腺病毒4型(FAdV-4)Hexon基因核苷酸序列,设计用于扩增FAdV-4的PCR引物,建立了FAdV-4 PCR检测方法。特异性和敏感性实验结果表明,该方法可扩增出954 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒与禽腺病毒11型的检测结果均为阴性,对FAdV-4的最低核酸检出量为12.9 pg。该方法可用于禽腺病毒4型的临床检测与流行病学调查。     

鸡细小病毒与禽呼肠病毒二重PCR检测方法的建立

建立可同时检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)与禽呼肠病毒(Avian reovirus,ARV)的二重PCR方法,为防控ChPV与ARV提供技术支撑。根据鸡细小病毒NS1基因和禽呼肠病毒σC基因的保守序列,设计合成两对引物用于检测ChPV和ARV,通过优化二重PCR的反应体系,特异性、敏感性试验评价建立的ChPV与ARV二重PCR。优化后的二重PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5μL,其中ChPV与ARV的上、下游引物各1.0μL,混合模板2.0μL,ddH2O补足25μL;最佳的反应程序为:95℃5min;95℃1min,56.1℃1min,72℃1min,35个循环;最后72℃延伸10min。结果显示,建立的二重PCR能够同时扩增出204bp ChPV和405bp ARV片段;该方法对ChPV与ARV的检测敏感性分别达到58fg和53fg,但对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒等病原体均无特异性扩增,对ChPV与ARV混合感染的临床阳性病料的检测结果与各病毒单项PCR检测结果符合率为94%以上。建立的二重PCR可用于ChPV与ARV感染的快速鉴别诊断。     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测试剂盒的研制及应用

为研制一种高效、快捷、灵敏的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)检测试剂盒,本研究根据FAdV-4的保守序列设计了一对引物及探针,并在下游引物标记FITC,探针标记Biotin,应用纳米PCR技术结合横向流动试纸条技术(LFD),优化反应及杂交条件后建立了检测FAdV-4的纳米PCR-LFD方法,并组装了FAdV-4纳米PCR检测试剂盒。同时对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性、稳定性、保存期评估等试验及临床样品检测。特异性试验表明,此试剂盒能够特异性检测出FAdV-4,而对于禽的其他主要病毒性及细菌性病原如鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病病毒(MDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒H9亚型(AIV(H9))、禽呼肠孤病毒(ARV)、FAdV标准株(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11)、鸡大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(SA)、鸡白痢沙门氏菌(SP)、鸡毒支原体(MG)的检测结果均为阴性。敏感性试验表明,此试剂盒的敏感性比常规PCR方法敏感10倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到56.0拷贝/μL。试剂盒的批内、批间检测结果具有良好的一致性和稳定性。稳定性试验结果说明试剂盒至少可以耐受20次的反复冻融,依然有很好的检测效果。保存期试验证实,试剂盒在4℃条件下至少可以保存3个月,在-20℃条件下至少可保存12个月。此试剂盒实现了对FAdV-4检测结果的可视化,简化了操作流程,提高了检测效率。对天津及周边地区临床送检的117份样品检测结果显示,FAdV-4阳性率为17.95%(21/117)。本试验研制的试剂盒可用于FAdV-4的临床诊断和分子流行病学调查,对养禽场FAdV-4感染的早期检测与制定综合防控措施提供了重要的技术支撑。     

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。     

Ⅰ群禽腺病毒通用型二温式PCR和VPCR方法的建立及初步应用

为建立快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)血清型通用PCR方法,根据FAdV-Ⅰ 12个血清型基因保守区设计引物,建立了二温式PCR和VPCR方法.结果显示:本研究建立的FAdV-Ⅰ二温式PCR方法,在90℃～94℃变性3 s、70℃～74℃退火兼延伸8 s,循环35～40次时,最快可在15 min内完成扩增;对分属5...     

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列，设计、合成1对引物，应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性，而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同〖JP2〗天数采集的鸡的结膜拭子，接种后第2~5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。     

鸡痘病毒PCR检测方法的建立及临床应用

根据已发表的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了(P3,P5)1对引物,通过对影响PCR扩增条件的优化,在不同的退火温度下,直接以病毒液为模板扩增出预期的1 107 bp的片段。特异性检测表明,两对引物对FPV102株、FPV282E4(北京)、大华农鸡痘疫苗毒株、重组鸡痘疫苗病毒及临床病料均能扩增出相应的特异性片段,而用鸡马立克氏病毒、传染性支气管炎病毒,鸽痘病毒及鸡胚成纤维细胞制备的模板进行PCR扩增均为阴性。敏感性检测表明,引物能检测0.195 ng/μL的模板量。用此方法检测50份临床样品,其中的阳性率为92%,用琼脂扩散试验方法检测的阳性率为70%。以上结果表明,该方法可以用于FPV临床样品的检测。     

鸭腺病毒3型PCR检测方法的建立

鸭3型腺病毒(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)为近年来新发的以引起鸭肝脏肿大出血、肾脏大面积出血点为特征的鸭群新发疫病。为建立特异性的检测DAdV-3的PCR方法,研究通过分析鸭群中鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭源禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸭2型腺病毒(DAdV-2)和DAdV-3的Fiber 2基因特征,建立特异性检测DAdV-3的PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为54℃,对DAdV-3扩增片段大小为548 bp;敏感性强,最低检测限为36.4 pg;特异性好,对DAdV-A、FAdV-4、鸭病毒性肠炎(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鹅多瘤病毒(GHPV)均无特异性扩增。表明该方法可有效用于开展新发DAdV-3的流行病学调查。     

鸡痘病毒PCR检测方法的建立

根据已发表的鸡痘病毒 (fowlpox virus,FPV) 4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了 2对引物 ,通过对影响PCR扩增因素的优化 ,2对引物在同一反应条件下 ,以抽提 FPV DNA或直接用其毒液制备的模板均能分别扩增出预期的 5 4 9、136 1bp的片段。特异性检测表明 ,2对引物对 FPV10 2株、FPV2 82 E4 (北京 )、FPV2 82 E4 (吉林 )、v FV2 82重组鸡痘疫苗毒及 FPV临床分离株均能扩增出相应特异性片段 ,而用鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、羊痘病毒、鸡胚成纤维细胞 (CEF)制备的模板分别进行 PCR扩增却成阴性。敏感性检测表明 ,2对引物 (p1 ,2 、g1 ,2 )分别能检测到 10 - 2 、10 - 3fmol的 FPV DNA和 10 0 .5、10 - 0 .5TCID50 的病毒。以上结果表明 ,本试验所建立的 FPV PCR检测法具有较高的特异性和敏感性 ,模板制作简单 ,完全可用于 FPV的检测     

基于双探针杂交的鸡心包积液综合征病原检测方法的建立与评估

为了建立一种基于双探针杂交的PCR检测方法,用于鸡心包积液综合征病原的鉴别检测。根据GenBank收录的FAdV-4六邻体hexon基因序列特征,选取2段长度为20 bp、序列相邻的保守区作为双探针,标记于报告基因大豆Lectin基因片段两端,用于PCR检测,建立了FAdV-4环介导PCR检测方法,扩增片段大小362 bp。灵敏性和特异性试验结果表明,该方法可以检出FAdV-4的最低极限浓度为7.85 pg/μL的核酸样品,与FAdV-11、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDV等其他常见禽病原体无明显交叉反应。利用所建立的方法对103份临床样品进行检测,结果显示,环介导PCR对FAdV-4检出率35.0%,高于常规PCR(32.0%)而接近于SYBR Green实时PCR(35.9%);Kappa值检验结果显示,环介导PCR和SYBR Green实时PCR对FAdV-4检测结果之间高度符合,Kappa值为κ=0.98。本试验成功建立了FAdV-4环介导PCR检测方法,可用于FAdV-4的临床检测和流行病学调查。     

禽腺病毒-Ⅰ群、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒多重PCR检测方法的建立

为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1 600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10~5拷贝/μL、8.93×10~2拷贝/μL和2.11×10~4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。     

Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种特异、敏感的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)检测方法,根据GenBank中FAdV-Ⅰ不同血清型Hexon基因序列,选择保守区域设计内、外2对特异性检测引物,通过反应条件的优化,建立了FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法。结果:该方法能够特异性扩增FADV-Ⅰ,而检测减蛋综合征病毒(EDSV)、鸡痘病毒(APV)、马立克病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DEV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)均为阴性;检测下限为10~(2.0) TCID_(50),灵敏度是普通PCR方法的100倍;对3个不同浓度FAdV-Ⅰ的批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致;相对于病毒分离鉴定方法的符合率为90.91%;用该方法检测91份临床病料样品,共检测出阳性样品58份,其中血清4型、8a型、8b型、11型阳性样品分别为38份、8份、7份、5份。结果说明本试验建立的FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性,能够用于FAdV-Ⅰ的临床检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒RPA-LFD检测方法的建立

为建立一种简便、快捷的现地检测鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的方法,本研究联合重组酶聚合酶扩增(RPA)和侧向流试纸条(LFD)技术,在优选的RPA上、下游引物的5'端分别进行异硫氰酸荧光素和生物素标记,通过引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化建立了一种可以用于ILTV现地检测的RPA-LFD方法。该检测方法在30℃～42.5℃恒温反应20 min即可实现对ILTV目的基因片段的有效扩增;与其它常见禽病病原DNA无交叉反应;RPA扩增产物直接用胶体金侧向流免疫层析试纸条肉眼观察,最低检测限为100拷贝/μL,比常规PCR灵敏度高100倍。结果表明,本研究建立的RPA-LFD检测方法灵敏度高,操作方便,可用于ILTV的临床快速检测。     

同时检测禽类六种病毒的金标银染可视化基因芯片的构建及初步应用

本研究旨在利用金标银染显色技术,构建同时检测禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克病病毒(MDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的可视化基因芯片。利用T-A法分别克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp_2基因,并利用本实验室已保存的AIV-np、NDV-f、ILTV-tk基因序列,设计寡核苷酸探针,制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV基因芯片阵列。引入生物素标记的引物进行PCR扩增,并与芯片进行杂交银染显色,肉眼观察检测结果,并对芯片的特异性、敏感性、稳定性进行评价,以及临床初步验证。成功克隆ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp_2共3个靶基因,测序鉴定其正确性。发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol·L~(-1),40℃条件下杂交2 h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的质量浓度为4μg·mL~(-1),银染5 min,可见明显的检测信号。特异性试验显示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应,且以鸡传染性支气管炎病毒为模板制备的PCR扩增标记不与ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV芯片杂交。芯片检测的灵敏度为1 pg·μL~(-1)。芯片在常温条件下保存60 d,在4℃条件下保存75 d仍可进行有效检测。临床病料检测结果与PCR检测结果一致。本研究成功构建同时检测ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的金标银染可视化基因芯片,并确定其最佳反应条件,为临床标准化应用奠定了基础。     

禽新型黄病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立了一种适用于禽新型黄病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法。根据禽新型黄病毒E蛋白基因序列,在保守区设计了一套针对禽新型黄病毒基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果表明该方法对NDRV、GPV、MDRV、NDV、ILTV、FPV均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,45min内可完成反应;该方法对禽新型黄病毒RNA的最小检测限为1pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的100倍。本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行禽新型黄病毒的快速检测。     

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列，设计、合成1对引物，应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段，测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性，而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同〖JP2〗天数采集的鸡的结膜拭子，接种后第2~5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。     

禽腺病毒DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

禽腺病毒属成员鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)和禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是养殖场主要流行的病原,对养禽业造成巨大的经济损失。目前尚未见可同时快速检测这2种病原的双重荧光定量PCR检测方法,本研究基于DAdV-3 GDMM10毒株和FAdV-4 GDMZ毒株Fiber2基因序列比对及遗传进化分析,分别在Fiber2基因保守区设计特异性引物,建立了能同时鉴别临床上常见的DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,DAdV-3 GDMM10和FAdV-4 GDMZ Fiber2基因处于两个不同进化分支上,同源性为46.10%。建立的检测DAdV-3和FAdV-4双重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,最低可检出45拷贝/μL的DAdV-3样品和17拷贝/μL的FAdV-4样品;且检测结果可直接通过Tm值差异进行判定,简化操作时间。利用该双重荧光定量PCR方法对2022年度临床上采集的34份肝炎-心包积液疑似样品进行检测,DAdV-3和FAdV-4检出率分别为17.65%和...     

禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立

为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。