miR-93对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响

为了分析血液外泌体miRNA对延边黄牛垂体细胞生长激素(GH)分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外泌体中存在显著差异表达的miR-93,分析其对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响机制。试验首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,之后将miR-93的mimics(miR-93-mi组)、mimics对照品(NC对照组)、inhibitor(miR-93-in组)、inhibitor对照品(iNC组)转染给已建立的垂体原代细胞,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白。试验利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-93的靶基因进行预测,并利用双荧光素酶报告基因系统对miR-93的靶关系进行验证;利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测靶基因mRNA转录和蛋白的表达情况,结果表明,miR-93靶向了生长激素释放激素受体(GHRHR)的3′UTR;与NC对照组比较,miR-93-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组(P0.01);miR-93-mi组的GHRH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组(P0.01),而miR-93-in组的GHRHR蛋白表达显著高于iNC对照组(P0.05)。说明miR-93可通过调节GHRHR的表达而调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

miR-93对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响

为了分析血液外泌体miRNA对延边黄牛垂体细胞生长激素（GH）分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外泌体中存在显著差异表达的miR-93,分析其对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响机制。试验首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,之后将miR-93的mimics（miR-93-mi组）、mimics对照品（NC对照组）、inhibitor（miR-93-in组）、inhibitor对照品（iNC组）转染给已建立的垂体原代细胞,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白。试验利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-93的靶基因进行预测,并利用双荧光素酶报告基因系统对miR-93的靶关系进行验证;利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测靶基因mRNA转录和蛋白的表达情况,结果表明,miR-93靶向了生长激素释放激素受体（GHRHR）的3'UTR;与NC对照组比较,miR-93-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）;miR-93-mi组的GHRH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）,而miR-93-in组的GHRHR蛋白表达显著高于iNC对照组（P<0.05）。说明miR-93可通过调节GHRHR的表达而调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

miR-1468对延边黄牛垂体细胞生长激素分泌影响的研究

为研究血液外胞体中miRNA对延边黄牛垂体细胞中生长激素(GH)分泌的影响,本研究选择在延边黄牛和韩延牛血液外胞体中显著差异表达的miR-1468,利用实时定量PCR(qPCR)和Western blot技术,研究了miR-1468对延边黄牛垂体细胞中GH分泌水平的影响及miR-1468与靶基因之间的调控机制。结果显示,miR-1468水平的增加能显著抑制延边黄牛垂体细胞中GH mRNA和蛋白的表达(P0.01),反之降低miR-1468水平能显著提高GH mRNA(P0.05)和蛋白(P0.01)的表达。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因系统结果显示,miR-1468靶向了环磷腺苷效应元件结合蛋白1(CREB1)的3′UTR;miR-1468水平的增加能够显著抑制CREB1 mRNA和蛋白的表达(P0.01),反之降低miR-1468水平能显著提高CREB1 mRNA和蛋白的表达(P0.01)。本研究表明,miR-1468可通过调节CREB1基因的表达而调控垂体细胞GH的分泌,该结果将为研究外胞体miRNA调控动物生长发育机制提供理论依据。     

小鼠miR-487b-3p对C2C12增殖和分化调控作用的研究

旨在研究miR-487b-3p对小鼠C2C12细胞增殖与分化的具体调控机制。本研究以小鼠成肌细胞系(C2C12)为研究对象,利用qRT-PCR检测miR-487b-3p在小鼠各组织和C2C12细胞增殖与分化过程中的表达情况;通过转染miR-487b-3p mimics和miR-487b-3p inhibitor后,利用qRT-PCR检测转染效率,并采用qRT-PCR和Western blotting检测增殖标记基因PCNA和分化标记基因MYOD、MYOG和MYHC的表达差异;利用生物信息学软件对miR-487b-3p靶基因进行预测,利用qRT-PCR检测小鼠C2C12细胞增殖与分化过程中PITX2的表达情况,并检测过表达(抑制)miR-487b-3p后PITX2的表达差异,通过双荧光素酶报告系统验证miR-487b-3p和PITX2的靶标关系。结果表明,miR-487b-3p在小鼠骨骼肌中相对表达最高,在C2C12细胞增殖与分化的过程中miR-487b-3p的表达量整体上呈现上升趋势,推测miR-487b-3p参与调控骨骼肌发育。过表达miR-487b-3p后,极显著上调miR-487b-3p的表达(P0.01),在转录和蛋白水平均极显著上调PCNA的表达(P0.01),显著下调MYHC、MYOD和MYOG基因的表达(P0.05),同时显著下调MYHC(P0.05)、MYOD(P0.01)和MYOG蛋白(P0.05)的表达;而抑制miR-487b-3p后,极显著下调miR-487b-3p的表达(P0.01),显著下调PCNA基因的表达(P0.05),极显著下调PCNA蛋白的表达(P0.01),显著上调MYHC、MYOD和MYOG蛋白的表达(P0.05),上调MYHC、MYOD和MYOG基因的表达,但未达显著水平(P0.05)。在C2C12细胞增殖和分化过程中,PITX2与miR-487b-3p表达趋势相反;过表达miR-487b-3p能极显著下调PITX2mRNA的表达(P0.01),相反,抑制miR-487b-3p的表达则极显著上调PITX2mRNA的表达(P0.01);双荧光素酶报告系统验证PITX2是miR-487b-3p的直接靶基因。综上表明,miR-487b-3p通过靶向PITX2促进C2C12细胞增殖而抑制其分化。     

miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

颗粒细胞是卵巢中必需的体细胞,在卵泡发育过程中起重要作用。为探究miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响,本实验中2个处理组分别转染miR-10b模拟物(miR-10b mimics)和miRNA模拟物(mimics NC),转染48h后,通过Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测内源miR-10b表达量,明确miR-10b mimics转染成功。利用qRT-PCR和Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达量的变化;利用流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示:与mimics NC组相比,miR-10b mimics组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著升高;同时miR-10b mimics组的细胞凋亡率较mimics NC组显著升高。结果表明,miR-10b可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。     

miR-23b-3p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和成脂分化的影响

为探讨miR-23b-3p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和成脂分化的影响,通过化学修饰的miR-23b-3p模拟物成功转入3T3-L1前脂肪细胞后,利用CCK-8法和流式细胞术检测过表达miR-23b-3p对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响;并通过实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞周期基因CyclinD1和CDK4以及成脂标志基因PPARγ和FABP4的表达情况;油红O染色测定甘油三酯积累情况。结果显示,过表达miR-23b-3p抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,导致细胞G1期阻滞,CyclinD1、CDK4在mRNA和蛋白水平极显著下调;在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中,miR-23b-3p的表达水平上调;过表达miR-23b-3p促进3T3-L1前脂肪细胞甘油三酯积累,PPARγ、FABP4在mRNA和蛋白水平显著或极显著上调。结果表明,miR-23b-3p能够抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖并促进其分化为成熟脂肪细胞。     

延边黄牛POU1F1基因PCR-SSCP多态性与生长性状关系的研究

为了研究延边黄牛117个个体的垂体特异转录因子(POU1F1)基因多态性及其与断奶体重、体尺等生长性状间的相关性,试验利用单链构象多态(PCR-SSCP)技术,对延边黄牛POU1F1基因第6外显子序列的SNPs进行检测。结果表明:延边黄牛群体POU1F1基因座位存在多态性,发现了2种等位基因(A/G),基因频率分别为0.515 6和0.484 4;该位点纯合度为0.500 5,杂合度为0.499 5,多态信息含量为0.374 8,属于中度多态,处于Hardy-Weinberg平衡状态。纯合基因型个体的POU1F1基因座位存在突变位点。POU1F1基因多态位点遗传分析表明,AB型个体较多,AA型和BB型个体较少。延边黄牛群体内AB基因型个体体长显著(P0.05)高于AA和BB基因型个体,育肥牛AB型个体胸深显著(P0.05)低于AA型个体,初步认为AB基因型为优势基因型,对选择有正向效应。提示POU1F1基因有可能作为延边黄牛生长性状的候选基因。     

鸡miR-10b-5p生物信息学及组织表达分析

【目的】 通过对苏禽3号肉鸡的miR-10b-5p进行靶基因预测、生物信息学分析及其在鸡不同生长时期组织表达变化规律研究,探索其在鸡肌肉生长发育中作用。【方法】 通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-10b-5p序列,利用Ensembl数据库查询并确定miR-10b-5p在基因组中的位置,根据前体序列构建系统进化树;使用miRDB、microT和TargetScan网站预测miR-10b-5p靶基因,并对靶基因进行GO功能和KEGG通路分析,进而揭示miR-10b-5p的基因功能。采用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-10b-5p组织表达量,探索其在大脑、小脑、垂体、下丘脑、胸肌、腿肌、卵巢、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中表达变化。【结果】 miRBase检索共获得59种动物59条miR-10b-5p序列,即每一种动物都只有一种miR-10b-5p形式。基因定位分析发现,鸡miR-10b-5p位于2号染色体上的HOX基因家族中。常见物种miR-10b-5p成熟序列比对分析结果表明,miR-10b-5p的成熟序列相似性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,miR-10b在哺乳类中的灵长目、啮齿目、鸟类、鱼类中各自先聚为一支,然后再共同聚为一类,这表明miR-10b在进化过程中是保守的。靶基因预测发现,miR-10b-5p共有300个靶基因。GO功能分析发现,靶基因主要富集到染色质组装和基因表达的转录后调控、组蛋白甲基转移酶复合物、转录因子复合物等功能。KEGG通路分析表明,靶基因主要富集到Wnt和p53信号通路上。组织表达分析显示,miR-10b-5p在检测的各个组织中均有表达;3日龄时大脑、小脑、垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量显著高于心脏、下丘脑、肾脏和肺脏等组织(P<0.05);90日龄时,垂体、胸肌、腿肌和大脑中miR-10b-5p表达量显著高于其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄时垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量均显著上升(P<0.05)。【结论】 鸡miR-10b-5p是组织广泛表达的miRNA,miR-10b在进化过程中是保守的,其可能通过Wnt及p53信号通路调控肌肉细胞增殖分化,进而调控鸡肌肉生长发育。     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

miR-18b-3p靶向SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的研究

本实验旨在研究miR-18b-3p及其靶基因SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的作用机制。采集3日龄公羊背最长肌,培养绵羊前体脂肪细胞并进行诱导分化,采用油红O染色检测细胞分化情况;通过TargetScan预测miR-18b-3p的靶基因,通过qRT-PCR测定miR-18b-3p、靶基因SCD以及分化标志基因PPARγ、CEBPα在分化过程中的时序性表达;分别转染miR-18b-3p过表达载体(mimics)或抑制载体(inhibitor)及阴性对照至前体脂肪细胞后,通过qRT-PCR及Western blot检测miR-18b-3p对SCD以及分化标志基因表达量的作用;采用双荧光素酶证明miR-18b-3p是否靶向SCD基因。结果表明:miR-18b-3p在分化过程中的表达量先上升后下降,在第6天表达量最高;SCD表达量低于阴性对照组(P0.01),PPARγ及CEBPα基因表达量均低于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量低于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积减少(P0.05);转染miR-18b-3p inhibitor后,SCD、CEBPα基因表达量均高于阴性对照组(P0.01),PPARγ基因表达量高于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量高于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积增加(P0.05);miR-18b-3p对SCD基因具有直接靶向作用。本实验首次在绵羊上证明miR-18b-3p可以通过靶向SCD抑制前体脂肪细胞分化,为绵羊选育给予分子育种技术支撑。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性，预测miR-17-3p的靶基因；通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达；采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系；使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明，生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因，且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性；转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组（P<0.05或P<0.01）；抑制miR-17-3p的表达后，PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3'UTR片段的载体的荧光活性（P<0.01）；过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05或P<0.01）；而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05）。这些结果说明，miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响

【目的】研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%～70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin, myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用...     

miR-194b-3p对马链球菌兽疫亚种粘附猪肾上皮细胞能力影响的研究

microRNA分子在调节宿主细胞应对细菌感染的过程中起重要作用。为研究miR-194b-3p对马链球菌兽疫亚种(SeZ)粘附猪肾上皮细胞(PK15)能力的影响,本实验将miR-194b-3pagomir和antagomir分别转染PK15细胞,检测SeZ对PK15细胞粘附能力的变化。结果表明:在PK15细胞中转染miR-194b-3p agomir,SeZ C55138粘附率显著下降;转染miR-194b-3p antagomir,SeZ C55138粘附率显著上升,确定了miR-194b-3p能够显著抑制SeZ C55138对PK15细胞的粘附。同时对其机制进行研究,显示PK15细胞表面CD44是miR-194b-3p的一个调控靶基因,miR-194b-3p通过调节CD44的表达参与影响了上述粘附过程。本实验为深入理解SeZ与PK15细胞的互作机制提供了线索。     

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将s...     

山羊骨骼肌中miR-133及其靶基因的表达规律与功能研究

旨在研究miR-133及其靶基因SRF在山羊骨骼肌组织和细胞中的表达情况,并探讨miR-133对SRF基因的靶向调控作用。首先利用qRT-PCR分别检测miR-133及其靶基因在初生、7月龄、18月龄的安徽白山羊和波尔山羊8个组织(心、肝、脾、肺、肾、小肠、脂肪、背最长肌)以及不同代数的山羊骨骼肌卫星细胞(F6、F9、F12)中的表达变化;采用qRT-PCR及Western印迹法检测miR-133对靶基因mRNA及蛋白质表达水平的影响。qRT-PCR检测表明,miR-133在心肌和背最长肌中的表达水平明显高于其它组织,其靶基因SRF的表达水平与其相反;miR-133在山羊骨骼肌卫星细胞中的表达水平随着细胞代数的增多而表达量增加;qRT-PCR及Western印迹法证实,miR-133对SRF蛋白表达的调控发生在转录后水平。综上表明,miR-133有望成为研究山羊骨骼肌生长发育的新型标志物;miR-133通过在转录后水平抑制SRF蛋白的表达参与调控山羊骨骼肌细胞增殖和分化,进而影响山羊骨骼肌的发育。