用PCR-SSCP方法大规模检测九龙牦牛公牛β-酪蛋白基因型的研究

为了大规模检测β-酪蛋白(β-CN)的不同遗传变异体,试验用Chelex 100树脂从九龙牦牛公牛(n=102)肉中快速提取基因组DNA,用巢式PCR特异性扩增β-CN基因(CSN2)部分片段,并对九龙牦牛公牛CSN2基因型进行单链构象多态性(SSCP)分析和测序验证。结果表明:九龙牦牛公牛中CSN2基因的A1A1、A1A2和A2A2的基因型频率分别为0.069,0.098,0.833,A2A2型(n=85)占绝对优势;A1和A2等位基因频率分别为0.132和0.868。说明PCR-SSCP方法可靠,能大规模检测九龙牦牛β-CN的基因型。     

九龙藏黄牛和九龙牦牛β-酪蛋白基因型分析

为比较九龙藏黄牛和九龙牦牛β-酪蛋白（β-CN）的遗传变异体,试验采用酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了九龙藏黄牛（n=42）和九龙牦牛（n=17）β-CN的基因型。结果表明,在九龙藏黄牛、九龙牦牛的β-CN中共检测到4 种等位基因,包括A1、A2、B、C,其中在九龙藏黄牛中有7 种基因型：A1A1、A1A2、BB、A1B、A2B、A1C、BC,优势等位基因为A1（频率0.702 4）,优势基因型为A1A1（频率0.547 6）;在九龙牦牛样本中有2 种基因型：A1A2、A2A2,优势等位基因为A2（频率0.764 7 ）。试验表明,九龙藏黄牛与九龙牦牛β-CN均表现出多态性,但优势等位基因明显不同。     

牦牛乳中上皮粘蛋白MUC1的遗传多态性研究

采用SDS－PAGE研究了108头麦洼牦牛和98头九龙牦牛乳MUC1的生化遗传特性，结果表明；牦牛乳MUC1呈现出多态性，表现为一条或两条迁移率不同的区带。SAS－PAGE分析发现4种分子量的MUC1区带，依次为A：208kd,B;200kd,C:196kd,D185kd，分子量大于荷斯坦牛。麦洼牦牛MUC1基因座受A、B、C、D4个复等位基因支配，有9种基因型；九龙牦牛乳MUC1基因座受A、C、D3个复等位基因支配，显示5种基因型，两品种牦牛乳MUC1基因型分布差异极显著（P＜0.01），并且均偏离哈代－温伯格定律（P＜0.01），麦洼牦牛乳MUC1基因座遗传变异程序大于九龙牦牛。     

牦牛和犏牛促卵泡素受体基因5′-侧翼区序列多态性研究

本研究旨在分析牦牛和犏牛促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)基因的多态性,为从遗传角度上解决其繁殖产仔率低的问题提供参考,为筛选繁殖性状分子标记奠定理论基础。研究采用PCRSSCP和直接测序技术,对麦洼牦牛、九龙牦牛、大通牦牛和犏牛共110头个体的FSHR基因5′-侧翼区进行遗传多态性分析,统计基因频率和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态性指标。结果表明,麦洼牦牛、大通牦牛和九龙牦牛FSHR基因5′-侧翼区核苷酸序列具有多态性,犏牛无多态性;麦洼牦牛存在AA、AB和BB 3种基因型,九龙牦牛和大通牦牛均存在AA、AB 2种基因型,AB基因型在3个牦牛品种中占绝对优势,等位基因A为优势等位基因;麦洼牦牛、九龙牦牛和大通牦牛的多态信息含量分别为0.3693、0.3565、0.3705,均达到了中度多态(0.25PIC0.5),表明各牦牛品种遗传变异较大。     

大通牦牛三个功能基因部分序列的PCR-RFLP研究

采用PCR-RFLP技术,检测了大通牦牛α_(S1)-酪蛋白(α_(S1)-casein,α_(S1)-CN)基因、κ酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因和生长激素(growth hormone,GH)基因部分序列的遗传多态性。结果表明大通牦牛群体中α_(S1)-CN基因PCR-RFLP位点呈单态;κ-CN基因和GH基因2个PCR-RFLP位点均呈多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.1117和0.8883;GH基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.1755和0.8255。适合性卡方检验结果表明,大通牦牛GH基因和κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布均极显著偏离Hardy-Weinberg平衡定理(P<0.01);该3个位点平均基因一致度和基因多样度分别为0.8374和0.1626。     

不同地方品种牦牛IGF-1基因的PCR-SSCP分析

为了检测高原地区4个不同地方牦牛品种IGF-1基因第1外显子和第2外显子的多态性,采用PCR-SSCP分析了牦牛IGF-1基因在天祝白牦牛、甘南牦牛、青海高原牦牛及培育品种大通牦牛4个品种中的遗传多态性。结果表明:牦牛IGF-1基因的第1外显子不存在遗传多态性;第2外显子在4个品种中检测到了AA、AB和BB基因型,而且A等位基因为4个牦牛群体的优势等位基因,分布较高。在4个品种中,天祝白牦牛AA基因型频率最高,达到0.8559,而大通牦牛、甘南牦牛和青海高原牦牛则相对较低,分别为0.8333、0.6970和0.5689。大通牦牛和天祝白牦牛,青海高原牦牛和甘南牦牛基因和基因型相近,其它牦牛群体之间基因和基因型存在差异。     

中国水牛乳蛋白基因型与酪蛋白胶束粒度的关联研究

本研究旨在分析中国水牛乳蛋白各亚型与乳蛋白粒径的关联。采用反向高效液相色谱法对160头泌乳中期的水牛进行多态性测定,并利用激光粒度仪分析水牛乳蛋白的粒径。结果显示:αs1-酪蛋白(αs1-CN)、β-酪蛋白(β-CN)和α-乳白蛋白(α-LA)存在A型和B型2种基因型,κ-酪蛋白(κ-CN)有A型、B型、C型和D型4种基因型,αs2-酪蛋白(αs2-CN)和β-乳球蛋白(β-LG)没有发现多态性。κ-CN和αs1-CN各亚型在乳蛋白面积平均径(D[3,2])上有显著差异,筛选出的6种αs1-β-κ-CN复合基因型在乳蛋白面积平均径(D[3,2])以及中位径(D50)上差异显著。综上,水牛αs1-β-κ-CN复合基因为AB-BB-AB型以及κ-CN的C等位基因均与乳蛋白粒度存在显著关联。     

麦洼牦牛UCP基因多态性及其与生长性状的遗传效应分析

为了探讨麦洼牦牛UCP2和UCP3基因多态性及其与生长性状的相关性,为牦牛育种工作中遗传标记的辅助选择提供数据参考,试验以97头麦洼牦牛为研究对象,采用直接测序法获得UCP2基因第1,2,3,4外显子及部分内含子和UCP3基因第3,6外显子及部分内含子序列,比对获得多态位点,研究其遗传多态性与麦洼牦牛生长性状间的关联性。结果表明:UCP2基因第4外显子检测到1个多态位点(T1 499C),第4内含子检测到2个多态位点(A1 766G、C1 925T); UCP3基因第6外显子检测到1个多态位点(T13 190C)。4个突变位点在麦洼牦牛粉嘴和纯黑类群中均处于HardyWeinberg平衡状态(P0. 05); 4个多态位点均表现为低度多态[多态信息含量(PIC)0. 25]。UCP2基因T1 499C位点CT基因型个体体重均值显著高于TT型(P0. 05)。说明麦洼牦牛UCP2和UCP3基因存在多态性,其中UCP2基因T1 499C位点可作为麦洼牦牛生长发育性状遗传育种辅助选择的分子标记。     

牦牛乳铁蛋白基因多态性及其与乳品质性状的关联分析

试验旨在检测牦牛乳铁蛋白（lactoferrin,LF）基因多态性,评估基因突变对牦牛乳品质性状的影响,以期丰富牦牛重要经济性状的分子遗传研究。应用PCR-SSCP方法,检测甘南牦牛、西藏牦牛和天祝白牦牛LF基因5'UTR和内含子4突变,结合甘南牦牛乳品质测定,评估基因突变对其乳品质性状的影响。结果表明,牦牛LF基因5'UTR检测到c.-568 G>A的突变,等位基因A₁和基因型A₁B₁频率最高,为优势等位基因和基因型;内含子4检测到c.499+56 C>A突变,基因型A₂B₂频率最高,为优势基因型,等位基因A₂为甘南牦牛和天祝白牦牛优势等位基因,而B₂为西藏牦牛优势等位基因;各类群牦牛检测区域多态信息含量（PIC）介于0.25~0.50,属中度多态。关联分析表明,甘南牦牛LF基因突变影响部分胎次甘南牦牛乳品质性状,其中5'UTR第2胎基因型A₁A₁和A₁B₁个体无脂固体物质百分含量显著高于B₁B₁个体（P<0.05）;内含子4第3胎基因型A₂B₂和B₂B₂个体乳脂率显著高于A₂A₂型个体（P<0.05）,第4胎基因型B₂B₂个体的乳脂率显著低于A₂A₂和A₂B₂型个体（P<0.05）。以上结果表明,甘南牦牛、西藏牦牛和天祝白牦牛LF基因存在多态性,甘南牦牛LF基因5'UTR、内含子4突变分别影响无脂固体物质含量和乳脂率,可以作为潜在的分子遗传标记。     

促黄体素LHβ基因的单核苷酸多态性与牛精液品质的相关分析

采用PCR-SSCP技术分析了LHβ基因的5′UTR和3个外显子在西门塔尔、夏洛来等种公牛中的遗传多态性。结果在所扩增的LHβ基因的5′UTR 2个目的片段和外显子1、3中均未发现PCR-SSCP遗传多态;在第2外显子中发现PCR-SSCP多态,有2种等位基因A和B,有3种基因型AA型、AB型、BB型。对多态片段的测序分析表明:在LHβ基因第2外显子中1个碱基G突变为A。适合性卡方检验表明,该位点的不同基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡。用最小二乘法分析LHβ基因第2外显子不同基因型与西门塔尔和夏洛来精液品质的相关性,发现LHβ不同基因型对冻精畸形率和射精量有显著影响,对其他性状的影响差异不显著。结果表明,西门塔尔和夏洛来牛LHβ基因应是影响精液品质的一个主效基因或与影响精液品质的主效基因紧密连锁。     

中甸牦牛mtDNA D-Loop区遗传多样性及系统进化分析

根据牦牛线粒体DNA序列设计引物,扩增获得了中甸牦牛线粒体D-loop区全序列,并以山羊为外属对牛亚科部分牛种(野牦牛、九龙牦牛、麦洼牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛、青海牦牛、大通牦牛、美洲野牛、欧洲野牛、印度野牛、亚洲水牛和普通牛)的mt DNA D-loop序列进行了系统进化分析,以期了解中甸牦牛的遗传多样性,从而为中甸牦牛遗传资源的保护、开发和利用奠定理论基础。结果表明:(1)中甸牦牛线粒体D-loop区序列长在890~910 bp之间,T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为28.78%、24.41%、32.34%和14.47%,存在一定的碱基组成偏倚性;(2)中甸牦牛共有13种单倍型,平均单倍型多样性(Hd)为0.983 3,平均核苷酸多样性(Pi)为0.005 34,遗传多样性较为丰富;(3)中甸牦牛与已知牛种mt DNA D-loop区序列双参数距离显示,其与麦洼牦牛距离最小(0.006),与亚洲水牛距离最大(0.179);(4)系统进化分析显示,中甸牦牛是我国众多家牦牛类群中的一支,与麦洼牦牛聚为一类,推测其可能与麦洼牦牛因地理位置存在基因交流,由共同祖先进化而来。     

中国荷斯坦牛乳蛋白多态性与泌乳性状相关性的研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对扬州大学实验农牧场255头中国荷期坦奶牛乳蛋白的多态性进行分型,并利用最小二乘法分析乳蛋白多态性与泌乳性能之间的相关性,结果表明:α-La呈单态,只表现BB一种基因型,β-Lg、αs1-CN、β-CN呈多态,β-Lg由A、B两种等位基因控制,基因频率均为0.5000,优势基因型为AB型,频率为0.6392。αs1-CN的B基因为优势基因,其频率为0.9765;β-CN的A基因为优势基因,基因频率为0.9667。方差分析表明:αs1-CN对乳蛋白含量有显著影响(P<0.05),β-CN和第一胎的产犊季节对第一泌乳期305天产奶量具有显著影响(P<0.05)。而胎次、产犊季节对产奶量与乳成分含量有显著影响(P<0.05)。     

牦牛MDHⅠ基因多态性及其与生长性状的关联分析

本研究旨在探讨牦牛细胞质苹果酸脱氢酶(cytoplasmic malate dehydrogenase,MDHⅠ)基因的遗传多态性及其与生长性状的关联性,以期为牦牛优良性状选育提供参考依据。选取5个牦牛类群(共178头),采集耳组织样提取DNA并构建DNA池,对MDHⅠ基因所有外显子设计特异性引物进行扩增测序,用Mega 5.2筛查SNPs位点,直接测序法鉴定其基因型,利用PopGene 32进行χ~2独立性检测、基因纯合度(Ho)、基因杂合度(He)、有效等位基因频率(Ne)和多态信息含量(PIC)分析,利用SPSS 24.0分析MDHⅠ基因与牦牛生长性状间的关联性。结果表明,申扎牦牛、类乌齐牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛均在外显子8区域发现1个突变位点(G23093C),属同义突变,有3种基因型:GC、CC和GG,5个牦牛类群中,GC基因型为优势基因型(类乌齐牦牛中GG为优势基因型),G为优势等位基因(斯布牦牛除外),在斯布牦牛中,G和C基因频率相等。χ~2适应性检验表明,申扎牦牛、类乌齐牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛均符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。MDHⅠ基因在申扎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛中属于高度多态(PIC0.5),在麦洼牦牛和类乌齐牦牛中属于中度多态(0.25PIC0.5);纯合度最高的是申扎牦牛和类乌齐牦牛。关联性分析结果表明,MDHⅠ基因不同基因型对类乌齐牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛体重有显著性影响(P0.05);且种间分析发现,MDHⅠ基因不同基因型对牦牛体重有显著性影响(P0.05),说明该基因可作为人工选育的分子标记。     

牦牛MDHⅠ基因多态性及其与生长性状的关联分析

本研究旨在探讨牦牛细胞质苹果酸脱氢酶（cytoplasmic malate dehydrogenase,MDHⅠ）基因的遗传多态性及其与生长性状的关联性,以期为牦牛优良性状选育提供参考依据。选取5个牦牛类群（共178头）,采集耳组织样提取DNA并构建DNA池,对MDHⅠ基因所有外显子设计特异性引物进行扩增测序,用Mega 5.2筛查SNPs位点,直接测序法鉴定其基因型,利用PopGene 32进行χ²独立性检测、基因纯合度（Ho）、基因杂合度（He）、有效等位基因频率（Ne）和多态信息含量（PIC）分析,利用SPSS 24.0分析MDHⅠ基因与牦牛生长性状间的关联性。结果表明,申扎牦牛、类乌齐牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛均在外显子8区域发现1个突变位点（G23093C）,属同义突变,有3种基因型：GC、CC和GG,5个牦牛类群中,GC基因型为优势基因型（类乌齐牦牛中GG为优势基因型）,G为优势等位基因（斯布牦牛除外）,在斯布牦牛中,G和C基因频率相等。χ²适应性检验表明,申扎牦牛、类乌齐牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。MDHⅠ基因在申扎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛中属于高度多态（PIC>0.5）,在麦洼牦牛和类乌齐牦牛中属于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）;纯合度最高的是申扎牦牛和类乌齐牦牛。关联性分析结果表明,MDHⅠ基因不同基因型对类乌齐牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛体重有显著性影响（P<0.05）;且种间分析发现,MDHⅠ基因不同基因型对牦牛体重有显著性影响（P<0.05）,说明该基因可作为人工选育的分子标记。     

九龙藏黄牛乳蛋白的组成及遗传多态性研究

本研究旨在了解生活在高海拔地区的藏黄牛乳的生化组成特点。试验测定了43头九龙藏黄牛乳蛋白含量、乳蛋白组成和酪蛋白多态性。藏黄牛乳蛋白含量低,仅约为29 g/L;电泳分析结果显示,脱脂乳蛋白组成与普通牛乳接近,主要包括酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白等组分,β-Lg与α-La含量的比值低于牦牛;酪蛋白的相对含量约为70%,主要包含α_s-CN和β-CN,二者分别检测到3和2种基因型。研究结果表明,九龙藏黄牛乳的组成与生活在类似生态环境中的九龙牦牛存在差异。     

西藏牦牛、荷斯坦牛三个功能基因部分序列多态性的比较研究

利用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术和聚合酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，测定了西藏牦牛和荷斯坦牛催乳素基因、β-乳球蛋白基因和κ-酪蛋白基因三个功能基因部分序列多态性。结果显示：西藏牦牛和荷斯坦牛在催乳素基因和κ-酪蛋白基因位点上存在多态性，而在β-乳球蛋白基因位点均未发现D等位基因。     

麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因的SNPs检测及其与体尺性状的关联分析

旨在探讨生长激素(Growth hormone,GH)、生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)、生长激素促分泌素受体(Growth hormone secretagogue receptor,GHSR)基因在麦洼牦牛中的遗传多样性,揭示不同基因型与其生长性状的关联性,同时为候选基因在牦牛中的表达调控提供理论依据,寻找可用于遗传育种辅助选择的分子标记。本试验采用DNA池技术,结合PCR-RFLP和直接测序法研究麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因的遗传多态性,分析候选基因多态位点与体高、体斜长、胸围、管围和体重等生长性状的关联性。结果表明:1)麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因均存在多态性,其中GH基因存在A757G和T949C2个SNPs位点,GHR基因发现T2416C、T3490C和A7500G3个突变位点;GHSR基因存在T1387C和T3006C突变;2)适合性检验表明,GHR基因A7500G位点在粉嘴类群,及GHSR基因T3006C位点在纯黑类群中偏离Hardy-Weinberg平衡状态,其他位点均符合Hardy-Weinberg平衡;3)差异显著性检验表明,GHR基因T2416C、T3490C和A7500G位点与麦洼牦牛管围极显著相关(P0.01),GHSR基因T1387C位点与其体重显著相关(P0.05)。麦洼牦牛GH、GHR、GHSR基因均存在遗传多态性,推断GHR基因T2416C、T3490C和A7500G位点、GHSR基因T1387C位点可能是影响麦洼牦牛管围、体重性状的主基因或与主基因相连锁的基因座,可作为辅助选择的遗传标记。     

兴义鸭CYP7A1基因外显子3多态性与血清生化指标的关联性研究

本研究采用PCR-SSCP和DNA直接测序技术相结合来检测兴义鸭CYP7A1基因外显子3的SNP位点,分析其与血清生化指标的关联性。结果表明,检测到3种基因型AA、AB和BB,2个等位基因A和B,AA和A分别为优势基因型和等位基因,频率分别为0.882和0.921,序列比对发现5个SNP位点G744A、G783A、T858C、C951G和G960A,均为同义突变。关联分析显示,BB基因型个体的血清白蛋白、球蛋白和总蛋白显著高于AA基因型(P0.05),AA基因型白球比值显著高于AB型(P0.05),推测CYP7A1基因外显子3的多态可能对兴义鸭血清蛋白有一定影响,BB基因型可能是血清蛋白组成的有利基因型,等位基因B可能是有利等位基因。     

智利进口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因多态性及其对泌乳性能的影响

本研究利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对江苏某大型奶牛场智利进口荷斯坦牛β-Lg(β-乳球蛋白)和β-CN(β-酪蛋白)基因多态性进行分型,同时收集采样牛只2016～2018年DHI检测结果,利用最小二乘模型分析其多态性及其对泌乳性能的影响。结果表明,在检测群体中β-Lg有A、B两种等位基因,基因频率分别为0.527和0.473,有AA、AB、BB三种基因型,优势基因型为AB型,频率为0.569;β-CN有A、B两种等位基因,其基因频率分别为0.960和0.040,有AA和AB两种基因型,优势基因型为AA型,频率为0.920。方差分析表明,β-Lg对日产奶量、乳蛋白率、体细胞评分(SCS)和尿素氮含量均有极显著影响(P0.01);β-CN对乳蛋白率和脂蛋白比有显著影响(P0.05),对日产奶量影响极显著(P0.01)。该结果为利用乳蛋白基因多态性提高智利进口荷斯坦牛泌乳性能提供了参考资料。     

牦牛品种的AFLP分析及其遗传多样性研究

采用AFLP分子标记技术对麦洼牦牛、九龙牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛进行了遗传多样性分析,结果表明:7个AFLP引物组合共获得156个片段,其中98个为多态性标记,标记多态频率为34.8%~54.65%,平均每对引物可获得17.57条带。九龙牦牛、麦洼牦牛、大通牦牛、天祝白牦牛的Shannon遗传多样性指数分别为0.268、0.251、0.160、0.130,九龙牦牛最大,麦洼牦牛次之,天祝白牦牛最小。用Rogers遗传距离公式分析得到4个牦牛品种间的遗传距离DR,天祝白牦牛与九龙牦牛遗传距离最大(0.028 2),天祝白牦牛与大通牦牛的距离最小(0.025 3)。根据DR值,将4个牦牛品种聚为两大类,九龙牦牛聚为一类,其它3个牦牛品种聚为一类。