口蹄疫病毒非结构蛋白3B的生物信息学分析

为详细了解口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)非结构蛋白3B的基本结构与功能,试验采用生物信息学方法研究了非结构蛋白3B的一般理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构、潜在的抗原表位,并对该蛋白进行了多重序列比对。结果表明:在NCBI数据库中检索到39个中国上传的口蹄疫病毒非结构蛋白3B序列,其中从新疆地区获得的分离株1株(Akesu/58),属于O型毒株,非结构蛋白3B具有71个氨基酸,分子式为C_(356)H_(596)N_(98)O_(93)S_1,相对分子质量为7 769.31,等电点为10.11,带负电荷氨基酸残基总数为6个,带正电荷氨基酸残基总数为16个,不稳定指数为28.67;亲水性平均系数为-0.731,无跨膜区,无信号肽;无糖基化位点,该蛋白在氨基酸序列第26位和第50位各存在1个酪氨酸磷酸化位点;二级结构延伸链占所有氨基酸比例的23.94%,β-折叠占所有氨基酸比例的4.23%,无规则卷曲占所有氨基酸比例的71.83%;三级结构蛋白覆盖率只有28%,可信度为10%;非结构蛋白3B有3个抗原决定簇,具有6个优势的B细胞抗原表位,4个优势的CD_8~+抗原表位,1个强结合多肽段和14个弱结合多肽段的CD_4~+抗原表位;非结构蛋白3B与NCBI公布的中国O型、A型和Asia 1型血清型核苷酸序列同源性分别为94.24%、91.55%和97.48%,氨基酸序列同源性分别为97.29%、92.96%、98.49%。说明非结构蛋白3B基因编码的蛋白质为亲水性蛋白,结构较为松散,同源性高,且具有保守的抗原决定簇,可作为区分疫苗接种和自然感染抗体诊断方法的候选蛋白靶标。     

貉源阿留申病毒VP2和NS1蛋白的抗原性预测

旨在预测和分析貉源阿留申病毒(RFAV)VP2和NS1蛋白的抗原表位特征,筛选阿留申病毒属较保守的B、T细胞抗原表位。本研究对RFAV的近全长基因组进行克隆及测序,对其VP2和NS1基因编码蛋白的理化性质、二级结构、翻译后修饰位点和抗原表位进行预测,并将预测的修饰位点、抗原表位与其他阿留申病毒种的序列进行比较分析,筛选相对保守的修饰位点和抗原表位。结果显示,获得的RFAV基因组长4 327 bp,编码VP2蛋白的636个氨基酸,编码NS1蛋白的641个氨基酸。VP2和NS1蛋白均为亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主。在阿留申病毒属内,VP2蛋白有3个保守的B细胞抗原表位,3个保守的T细胞表位,8个保守的翻译后修饰位点;NS1蛋白有1个保守的B细胞抗原表位,2个保守的T细胞抗原表位和7个保守的翻译后修饰位点。本研究成功克隆了RFAV近全长基因组序列,全面对RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点进行预测,并分析其在阿留申病毒属内的保守和变异特征,为阿留申病毒免疫研究提供参考。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%～98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

1株J亚群禽白血病病毒env基因克隆及生物信息学分析

【目的】通过生物信息学方法分析1株禽白血病病毒(Avian Leukosis virus, ALV)的囊膜蛋白env的分子特征。【方法】利用鸡成纤维细胞(DF-1)培养疑似禽白血病病鸡的血清样品,通过ELISA和实时荧光定量PCR鉴定ALV亚群。对env基因PCR产物进行测序,利用SeqMan拼接env基因。将该env基因与国内外多个ALV亚群进行序列比对及遗传进化分析,并借助多种生物信息学软件对env蛋白进行分析,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、乙酰化位点、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位预测。【结果】ALV-J毒株的env基因全长1 719 bp,获得GenBank登录号为OP837418,其与J亚群ALV位于同一进化分支,相似性为89.3%～94.8%。该env蛋白有2个跨膜区,是由572个氨基酸组成的不稳定的亲水蛋白,不稳定系数预测值为43.49,总平均亲水性为―0.201;该env蛋白为非分泌蛋白,无信号肽,有17个N-糖基化修饰位点、77个O-糖基化修饰位点、42个磷酸化修饰位点、21个潜在抗原决定簇和9个连续碱基数超过10个...     

貉源阿留申病毒VP2和NS1蛋白的抗原性预测

旨在预测和分析貉源阿留申病毒（RFAV） VP2和NS1蛋白的抗原表位特征，筛选阿留申病毒属较保守的B、T细胞抗原表位。本研究对RFAV的近全长基因组进行克隆及测序，对其VP2和NS1基因编码蛋白的理化性质、二级结构、翻译后修饰位点和抗原表位进行预测，并将预测的修饰位点、抗原表位与其他阿留申病毒种的序列进行比较分析，筛选相对保守的修饰位点和抗原表位。结果显示，获得的RFAV基因组长4 327 bp，编码VP2蛋白的636个氨基酸，编码NS1蛋白的641个氨基酸。VP2和NS1蛋白均为亲水性蛋白，二级结构以无规则卷曲为主。在阿留申病毒属内，VP2蛋白有3个保守的B细胞抗原表位，3个保守的T细胞表位，8个保守的翻译后修饰位点；NS1蛋白有1个保守的B细胞抗原表位，2个保守的T细胞抗原表位和7个保守的翻译后修饰位点。本研究成功克隆了RFAV近全长基因组序列，全面对RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点进行预测，并分析其在阿留申病毒属内的保守和变异特征，为阿留申病毒免疫研究提供参考。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒（FPV）北京株（FPV-BJ 05株）NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007 bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

猫细小病毒VP2基因克隆与生物信息学分析

为了解猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）VP2蛋白的分子特点及变异规律,克隆FPV山东分离株SD-01的VP2基因,对其进行生物信息学分析。首先,以FPV阳性病料基因组DNA为模板,PCR扩增VP2基因并克隆获得重组质粒pMD18-T-FPV SD-01-VP2。测序结果显示：VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;氨基酸同源性比对发现,与其他FPV分离株的VP2基因氨基酸同源性较高,可达99.0%~100%。生物信息学分析结果显示：VP2蛋白为非分泌型的亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域;二级结构中α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲分别占8.7%、24.5%、4.3%和62.5%;三级结构预测发现,VP2蛋白以无规则卷曲为主,与二级结构预测结果一致。亚细胞定位预测显示,VP2蛋白不含有线粒体导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP）,定位在细胞质和细胞核中的概率较高,分别为47.8%和26.1%。B细胞抗原表位预测结果显示,VP2蛋白的抗原性及表面可及性较高,共含有11个潜在的优势B细胞抗原表位。蛋白翻译后修饰预测结果显示,VP2蛋白可能含有49个潜在磷酸化修饰位点,6个N-糖基化修饰位点和21个O-糖基化修饰位点,且这些修饰位点在FPV VP2蛋白内高度保守。本研究有助于了解我国FPV流行情况,掌握其重要结构蛋白VP2的理化性质和特性,从而为下一步VP2蛋白功能研究和疫苗研发奠定了基础。     

MDRV-YB株σNS蛋白结构与功能的生物信息学分析

为了获取番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白结构与功能的相关生物学信息,试验通过克隆测序获取MDRV-YB株σNS基因序列,并运用相关生物信息学软件对σNS蛋白结构与功能进行生物信息学分析。结果表明:MDRV-YB株σNS蛋白的编码区大小为1 104 bp,编码367个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,具有4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,但不含潜在的信号肽序列;二级结构分析显示,α-螺旋结构、β-折叠结构、β-转角结构、无规卷曲的氨基酸残基分别占40.2%、42.1%、8.97%和8.97%;推导氨基酸序列的遗传进化树分析显示,MDRVYB株与传统型MDRV的遗传进化关系较近,与新型MDRV及鸡源呼肠孤病毒(CRV)遗传进化关系较远。说明σNS蛋白作为非结构蛋白参与病毒的复制过程,且具有较高的保守性。     

猪细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株序列,利用Oligo 6.0软件设计1对扩增NS1全基因的特异性引物,对从贵州省安顺地区检测到的PPV的NS1基因进行扩增、克隆、测序、序列分析和蛋白质结构预测分析。测序结果表明,扩增的目的基因长度为1986 bp,共编码659个氨基酸,其中NS1基因的1287、1288和1298位碱基发生了缺失,导致429、430和433位氨基酸发生缺失。系统发生树结果表明,本试验测序的NS1基因与NADL-2弱毒株处在同一进化分支;氨基酸同源性与NADL-2弱毒株和Kresse毒株最高,均为98.6%。蛋白质结构预测分析结果表明,非结构蛋白NS1的分子质量为75269.76 u,理论等电点pI为7.25,不稳定系数为41.57,推测其为不稳定蛋白质;脂肪指数为73.58,总体平均亲水性为-0.565,推测该蛋白质是一种亲水性蛋白质;该蛋白质含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈连续分布;非结构蛋白NS1无跨膜区和信号肽;预测非结构蛋白NS1含有3个N-糖基化位点、3个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、22个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点及1个ATP/GTP结合位点基序A(P-环);该蛋白质抗原表位较多,存在10个主要的抗原表位。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA12的生物信息学分析

为分析并预测弓形虫致密颗粒蛋白GRA12基因编码蛋白的结构、功能以及其作为疫苗候选抗原的可能性,本研究从Gen Bank数据库获取GRA12基因序列,通过在线蛋白分析专家系统(Expasy)并结合GENERUNR、DNAStar、DNAMAN等生物信息学分析软件对GRA12序列的编码区进行分析、对该基因编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等信息预测。结果表明:该基因全长1 311 bp,编码436个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为47.8 ku,无信号肽,有6个跨膜区,14个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点、3个酪氨酸磷酸化位点、18个O-糖基化位点、3个乙酰化蛋白附着位点、1个酪氨酸硫酸化位点、1个潜在的N-糖基化位点、1个棕榈酰化位点,15个潜在的抗原表位。研究结果分析说明GRA12有潜力成为弓形虫疫苗候选抗原。     

BVDV TC株E0基因克隆和序列分析及SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种基于牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)囊膜蛋白E0基因的实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GenBank数据库中BVDV E0基因序列设计特异性引物,扩增BVDV新疆塔城分离株TC株的E0基因并克隆至pBM23载体中并测序鉴定;根据测序结果对E0基因的基本理化性质、B细胞抗原表位、二级结构、三级结构等进行生物信息学分析;以pBM23-E0为标准质粒,10倍梯度稀释后建立实时荧光定量PCR标准曲线。结果表明:BVDV TC株E0基因长度为681 bp,与已发表的BVDV1 V070株E0基因氨基酸同源性为97.36%;生物信息学分析表明,E0蛋白为稳定的亲水性蛋白,该蛋白有4个O-糖基化位点和19个磷酸化位点,11个潜在的B细胞抗原表位。二级结构以无规则卷曲为主,并用SWISS-MODEL构建出E0蛋白的三级结构;成功绘制出检测BVDV TC株E0基因荧光定量PCR的标准曲线,相关系数(R~2)0.998 0。说明成功建立了基于BVDV E0基因的实时定量PCR的检测方法。     

鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的生物信息学分析

为了分析鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的蛋白质结构以及预测其作为疫苗候选抗原的可能性,试验采用蛋白分析专家系统(Ex PASy)、DNAMAN、DNAStar、Gene Runner等生物信息学软件,对SAG17的开放阅读框、理化性质、信号肽、二级结构、跨膜结构域、亲/疏水性、修饰位点以及抗原表位等进行分析与预测。结果表明:SAG17全长813 bp,其蛋白由270个氨基酸组成,理论分子质量为28 741.23 u,分子式为C1252H1979N339O411S12,原子总数为3 993个,等电点为4.81,含有7个丝氨酸磷酸化位点、16个苏氨酸磷酸化位点、2个酪氨酸磷酸化位点、7个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点、2个赖氨酸ε-氨基糖基化位点、1个GPI修饰位点、4个SUMO蛋白附着位点、13个潜在的抗原表位、4个跨膜区,无信号肽。在SAG17基因中α螺旋占44.44%,β转角占10.00%,无规卷曲占32.59%,延伸链占12.96%,含有13个抗原表位。说明SAG17具有潜在的免疫原性,可用于研制安全、高效的球虫疫苗。     

牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白的生物信息学分析及多表位筛选

本研究旨在对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3蛋白进行生物信息学分析及T细胞和B细胞表位的筛选。从GenBank数据库中找到NS3蛋白的氨基酸序列,用Expasy ProtParam在线服务器分析所得序列理化性质。使用TMHMM Server分析跨膜结构域,使用DNAStar软件预测NS3蛋白的二级结构,为了更准确地预测蛋白质的二级结构,使用SOPMA分析软件进行了二次预测。使用Phyre2在线服务器预测NS3蛋白的三级结构,并用Raswin软件标出各个元素所处的位置。使用4种预测软件(BCPREDS、ABCpred、BepiPred和SVMTriP)分析NS3蛋白的线性B细胞表位,使用NetMHCⅡpan预测CD4~+ T细胞表位,使用NetBoLApan和IEDB预测CD8~+ T细胞表位,将所得到的结果进行T细胞和B细胞表位筛选。结果表明,NS3蛋白质由683个氨基酸组成,分子质量为75 ku,理论等电点(pI)为8.31,化学式为C_(3347)H_(5346)N_(916)O_(1009)S_(28),不稳定系数为35.93,平均亲水性(GRAVY)值为-0.267,表明NS3为稳定性亲水蛋白质。TMHMM结果显示,NS3蛋白不具有跨膜结构域。SOPMA结果表明,在NS3蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别约占30.75%、22.55%、8.35%和38.35%,用DNAStar软件分别标出了α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲所处的位置。运用4种不同的B细胞预测软件筛选出8个线性表位:12-16、289-298、349-360、394-407、421-432、489-498、515-525和665-679位氨基酸。用NetMHCⅡpan筛选出4个T细胞表位:248-262、315-320、400-414和482-496位氨基酸。本研究为BVDV NS3蛋白优势抗原的筛选提供了理论依据。     

气肿疽梭菌CctA全长基因的克隆及生物信息学分析

为了解气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)细胞毒素CctA的生物学功能,参照GenBank中ATCC 10092株序列设计特异性引物,试验采用PCR技术扩增获得CctA基因。通过生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA基因进行序列分析,并对其编码蛋白质的结构和功能进行预测。结果表明:CctA基因编码317个氨基酸;CctA基因编码蛋白质是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白,无跨膜区域,但存在信号肽,含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。说明CctA基因是气肿疽梭菌的重要毒力因子,为预防黑腿病疫苗的候选抗原,本试验成功克隆CctA基因,并分析了其编码蛋白的特性,为进一步研究气肿疽梭菌CctA基因功能及其重组蛋白提供参考。     

骆驼斯氏副柔线虫NCC基因原核表达载体的构建及生物信息学分析

本试验旨在构建原核表达载体pET30a(+)-NCC,对斯氏副柔线虫NCC基因特性进行生物信息学分析。应用RT-PCR技术扩增斯氏副柔线虫NCC基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),利用生物信息学软件对序列结构与抗原表位进行分析。结果显示,NCC基因全长711bp,编码237个氨基酸,蛋白质理论大小值为25.252ku,理论等电点为6.33,蛋白质不稳定指数为40.08;跨膜结构和信号肽分析表明NCC蛋白存在1个跨膜区,无信号肽区域,其磷酸化位点分布位于丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基上。NCC蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,既含有较多潜在的B细胞抗原表位又存在较多的T细胞抗原表位,本试验为斯氏副柔线虫诊断方法的建立及免疫防控提供参考。     

弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

为了分析并预测弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1(Tg MAPK1)基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原及潜在药物靶点的可能性,试验从Gen Bank数据库获取Tg MAPK1基因序列,采用在线蛋白分析专家系统(http://ca.expasy.org/),结合DNAMAN、DNAStar等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等。结果表明:该基因全长为1 772 bp,编码区为133~1 731 bp,编码532个氨基酸。编码蛋白性质稳定,理论分子质量为58.376 ku。Tg MAPK1蛋白有5个跨膜区,有3个N端糖基化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个环腺苷酸蛋白激酶磷酸化位点、10个N端肉豆蔻酰化位点及1个酰胺化位点;无信号肽,二级结构以无规卷曲为主;Tg MAPK1基因主要存在于弓形虫虫体外膜上,有20个潜在的抗原表位。说明弓形虫Tg MAPK1基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。     

鹅细小病毒非结构蛋白和结构蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测

利用DNAStar软件包中的Editseq将GPV H1株非结构蛋白和结构蛋白核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,分别预测结构蛋白和非结构蛋白的二级结构及B细胞抗原表位。结果表明,GPVH1株非结构蛋白和结构蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,其中非结构蛋白的NS2和结构蛋白的VP3含有较多的潜在的B细胞优势抗原表位。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的研究

蛋白质抗原表位 (抗原决定簇 )是蛋白质抗原性的物质基础 ,一个蛋白质分子可带有多个不同的抗原决定簇 ,即抗原表位 (epitopes)。通常 ,抗原表位是指氨基酸序列已经清楚的抗原决定簇。蛋白质抗原表位的研究 ,对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。B细胞蛋白抗原表位的预测自从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来 ,已有许多参数、算法发表 [1～10],对B细胞蛋白抗原表位研究起到了巨大的推动作用。本文就猪瘟病毒(SFV)E2蛋白抗原表位的研究概况作一介绍。1猪瘟病毒E2抗…     

猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase,PFKL)基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2 349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C_(3674)H_(5897)N_(1051)O_(1109)S_(40)。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。     

副猪嗜血杆菌丝氨酸蛋白酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)丝氨酸蛋白酶(espP)作为疫苗候选抗原的可能性,根据GenBank中Hps espP基因(登录号:HAPS_1381)设计引物,以Hps血清11型(H456)菌株的DNA为模板,PCR扩增目的基因并测序。将该基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列后,对Hps espP蛋白的信号肽、亲水性区域和B细胞抗原表位进行预测,并预测了该蛋白C端的3D结构。结果显示,Hps espP基因序列全长2 343 bp,共可编码781个氨基酸,其中氨基酸序列的1—23位预测为信号肽。Hps espP蛋白含有12个亲水性区域,并预测含有12个B淋巴细胞抗原表位。构建Hps espP蛋白3D结构显示,该蛋白C端是由12个β折叠层围成的桶状结构。本试验为进一步研制新型副猪嗜血杆菌Hps espP蛋白多肽疫苗奠定基础。