猪圆环病毒2型Cap蛋白毕赤酵母分泌表达及发酵条件优化

为实现猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白在酵母中的高效表达,本研究将去除信号肽并经序列优化后的PCV2 ORF2片段插入pPICZαA表达载体,将重组表达质粒克隆转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33感受态细胞中,应用Zeocin抗性和PCR法对转化子进行初步筛选和表型鉴定,利用"双膜法"筛选出PCV2 Cap表达量相对较高的酵母。采用正交试验对优选的酵母进行发酵试验,分析培养基pH、甲醇诱导时间、甲醇诱导浓度和诱导时酵母浓度对PCV2重组Cap蛋白(rCap)分泌表达的影响。结果显示酵母分泌表达PCV2 rCap的优化条件为:培养基pH为5.0,发酵液OD600nm至1.0,加入终浓度1.0%甲醇诱导96 h。优化后的PCV2 rCap分泌量可达207.58μg/m L。中和试验结果显示,发酵产物PCV2 rCap免疫小鼠产生的抗体可有效中和PCV2。本研究为利用酵母表达PCV2 Cap进行疫苗研制奠定了基础。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒2a和2b双亚型Cap蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及对小鼠的免疫效果试验

试验通过PCR分别获得PCV2a和PCV2b的Cap基因,顺次克隆入pFast Bac-Dual载体质粒,获得携带2a和2b型Cap基因的重组质粒Cap-pFast Bac Dual,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Cap-Bacmid,以脂质体法将重组杆粒转染Sf9细胞,获得表达Cap蛋白的重组杆状病毒。PCR能从重组杆状病毒中扩增出相应大小的Cap基因片段,蛋白电泳和ELISA法鉴定表明,Cap蛋白成功表达。采用重组杆状病毒肌内注射免疫小鼠(每只相当于8μg Cap蛋白),免疫后14 d血清中产生PCV2抗体,免疫后28 d用PCV2a和PCV2b强毒株攻击,荧光定量PCR法检测结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2基因组拷贝数极显著低于未免疫对照组。结果表明,PCV2a和PCV2b双亚型重组Cap蛋白能开发成猪圆环病毒防控的新型疫苗。     

猪圆环病毒2型ORF2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

为探索猪圆环病毒2型ORF2基因(PCV2 ORF2)的高效表达,本实验将ORF2基因整合到酵母表达载体p GAPZαA中,构建重组质粒p GAPZαA-ORF2。通过AvrⅡ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌X33中。经ZeocinTM抗性筛选得到转化子,在GAP强启动子调控下,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果证实Cap蛋白在酵母载体p GAPZαA中得到成功分泌表达。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

为了建立起双抗体夹心ELISA定量测核衣壳蛋白(caspid protein,Cap)抗原方法,采用氯化铯密度梯度超速离心方法制备猪圆环病毒2型Cap蛋白标准品,制备出针对PCV2-Cap单克隆抗体及PCV2-Cap多克隆抗体,筛选最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度,绘制标准曲线,验证方法,并应用该方法对不同转移载体构建的PCV2-Cap蛋白随时间变化的表达量进行测定。结果显示:最佳包被抗体和酶标抗体的稀释度均为1∶10 000,标准曲线的范围是15.6~250 ng/m L,线性相关系数≥0.99,准确性为(103.46±12.50)%,特异性良好;检测不同转移载体构建的Cap表达量随时间的变化,发现Cap含量接种后24 h开始表达,72 h达到高峰,呈S形曲线增长模式。结果表明:已建立的双抗体夹心ELISA定量测Cap抗原方法灵敏度、精密性和准确性均符合研究要求。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的表达

为探索猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ) ORF2基因的高效表达,将ORF2基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建重组质粒pPICZαC-ORF2,通过SacⅠ酶切线性化,经电穿孔法转到毕赤酵母菌SMD1168。经Zeocin^TM抗性筛选得到转化子,通过SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,结果表明衣壳蛋白在酵母菌中成功分泌表达。     

新疆株猪圆环病毒3型Cap基因的序列分析及原核表达

克隆并原核表达新疆株猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap)基因,为PCV3检测试剂的研发奠定基础。采用PCR扩增PCV3新疆分离株的Cap基因,采用Chou-Fasman法、Karplus-Schulz法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法预测蛋白的二级结构、蛋白质骨架区的柔韧性、亲水区/疏水区、可及性和抗原指数,将PCV3 Cap基因克隆到pEASY-Blunt Simple载体,经HindⅢ、NdeⅠ双酶切,亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap,测序验证后转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达的重组蛋白进行分析鉴定。结果显示,成功扩增并克隆到新疆株PCV3 Cap基因,通过序列分析发现所获PCV3 Cap基因与参考毒株的同源性为98.0%～98.6%之间,推导氨基酸有6个点突变,分别位于24、27、29、56、75、77和150aa位置;在11-17、37-41、54-60、97-101、119-134、138-140、142-146、155-160、170-172、175-181和192-202aa含有潜在B细胞抗原表位。构建了重组原核表达质粒pET30a-PCV3-Cap,并在大肠埃希氏菌中表达了重组PCV3 Cap蛋白,分子质量约为32 ku,该重组蛋白以包涵体的形式存在,Western blot鉴定表明,带His标签的重组蛋白能被His单克隆抗体识别。成功克隆并原核表达了新疆株PCV3衣壳蛋白,为PCV3诊断试剂的研发奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析

利用毕赤酵母系统表达O型口蹄疫病毒VP1基因,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。将VP1基因克隆入毕赤酵母分泌性表达载体pPICZα-C中,获得重组表达载体pPICZαC-VP1。将重组质粒pPICZαC-VP1线性化后,用电穿孔法转入酵母菌X-33,用Zeocin+YPDS平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并用酵母表达的VP1蛋白免疫小鼠,然后通过ELISA检测抗体水平。结果表明,酵母所表达的VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

猪流行性腹泻病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

为了研制一种能够高效表达猪流行性腹泻病毒S1主要抗原表位基因的新型疫苗,将S1主要抗原表位基因整合到酵母表达载体pPICZαC中,构建了重组质粒pPICZαC-S1,对重组质粒经Sac Ⅰ酶切线性化后通过电转化法转化到毕赤酵母X-33中,经Zeocin^TM抗性筛选后得到阳性转化子(pPICZαC-S1),转化子接种培养基后用甲醇进行诱导,并对诱导结果进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定。结果表明,纤突蛋白主要抗原表位在毕赤酵母中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为42 ku,且能够与PEDV阳性血清特异性结合。     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

禽网状内皮组织增生病病毒env蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究

为评价禽网状内皮组织增生病病毒(REV) env蛋白的免疫原性,本研究将env基因克隆至毕赤酵母表达载体pAO815,构建了含有两个env表达盒(已突变env基因中BglⅡ和Bam HⅠ酶切位点)的重组表达质粒pAO815-2env,并电转至毕赤酵母宿主菌GS115,构建重组酵母菌株pAO815-2env/GS115,经发酵培养得到的env蛋白(蛋白含量达到4.8 g/L)经亲和层析纯化后免疫SPF鸡,利用ELISA试剂盒和中和试验检测血清中的REV抗体。结果显示,重组酵母菌株表达的env蛋白,不仅能够诱导SPF鸡产生抗REV抗体,还能诱导其产生中和抗体,且产生的中和抗体效价较高,具有良好的免疫原性。本研究为开展禽网状内皮组织增生病亚单位疫苗的研制提供了实验依据。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性纳米抗体的原核表达研究

为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。     

抗猪圆环病毒2b/2d亚型衣壳蛋白纳米抗体的制备与鉴定

采用原核表达系统表达了PCV2b/2d-Cap的重组纳米抗体，并对其与PCV2b和PCV2d亚型Cap蛋白的结合能力进行了初步探索。以羊驼筛选到的纳米抗体基因为模板，通过PCR将纳米抗体基因片段进行扩增。经双酶切及连接反应后，将纳米抗体基因片段(VHH)插入到经改造的pET28a-SUMO载体中，构建了pET28a-SUMO-VHH重组质粒。将构建好的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达。表达产物通过亲和层析、除去SUMO标签以及分子筛凝胶过滤层析进行纯化。并通过Bio-dot Western blot和间接ELISA方法检测了该纳米抗体与PCV2b/2d-Cap蛋白的结合能力。结果显示，构建的重组质粒测序正确；经纯化得到的纳米抗体蛋白约为14 kDa;间接ELISA证实该纳米抗体对PCV2b/2d-Cap蛋白检测下限均为0.68 mg/L。结果表明，该纳米抗体与PCV2b和PCV2d亚型Cap蛋白均具有交叉反应，为PCV2b/2d亚型的临床检测建立新型诊断方法奠定了基础。     

重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的优化及蛋白免疫原性研究

为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示:2.0×10^6/mLHigh five细胞浓度、1.5MOI病毒感染量、蛋白表达时间168h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在High-five细胞中的表达条件优化、鉴定及免疫原性研究

为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示：2.0×106/mL High five细胞浓度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表达时间168 h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。     

毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

柞蚕溶菌酶真核表达系统的构建及重组蛋白纯化分析

利用甲醇营养型毕赤酵母对柞蚕溶菌酶进行高效重组表达。首先根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶成熟肽基因进行密码子优化,将优化后的基因序列ApLyz克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA中,构建重组表达载体pPICZαA-ApLyz。重组载体经电转化整合入毕赤酵母菌株GS115基因组中,并利用高质量浓度Zeocin(500μg/mL)抗性平板筛选得到高拷贝转化子。摇瓶发酵显示,甲醇诱导72 h后,高拷贝菌株发酵液中溶菌酶活性为450 U/mL(313 U/mg总蛋白),酶活约为单拷贝菌株的3.1倍。纯化后的重组柞蚕溶菌酶分子质量约14 kDa,酶活为3 870 U/mL,比酶活为20 262 U/mg。酶学性质分析显示,重组柞蚕溶菌酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.5,具有较好的热稳定性。