枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺研究（摘要）

[目的]优化枯草杆菌重组水蛭素的分离纯化工艺。[方法]通过系列预处理和初步层析和精细纯化试验。发酵液固液分离和预处理：大批的发酵液采用连续流离心,取上清液,滴加50%三氯乙酸,当pH值达到2.2～2.5时停止滴加,静置1 h,离心,取上清液,用饱和NaOH调pH值回中性。然后利用SYNDER-UF202型超滤装置进行超滤浓缩脱盐,先用孔径为0.1μm的滤膜芯进行微滤除大固粒,再用截留分子量为1 000 Da的超滤膜芯进行超滤浓缩,加蒸馏水重复超滤浓缩脱盐。然后在等电点pH 4.0左右进行6倍体积的乙醇沉淀浓缩。离子交换初步层析：最佳pH值8.0,以Tris-HCl缓冲体系为佳;强阴离子交换选用Q Sepharose F.F.介质;系统电导率6 ms/cm,水蛭素的最大上样量以每毫升介质240 ATU为佳,流速1 ml/min;优化工艺在强阴离子交换HiPrep 16/10Q上放大。Sephacryl S-100凝胶过滤柱纯化水蛭素：在一定流速范围内,流速对纯化效果影响不大,上样量可在10ml左右。[结果]优化的分离纯化路线为：大量发酵液→离心→三氯乙酸处理（91%回收率）→再离心→超滤浓缩脱盐（80%回收率）→乙醇沉淀浓缩（82%回收率）→强阴离子交换（90%回收率）→硫酸氨沉淀浓缩（90%回收率）→Sepharcyl S-100凝胶过滤（回收率93%）→纯品（总回收率=91%×80%×82%×90%×90%×93%=45%,纯度95.1%）。[结论]可为进一步工业化分离纯化水蛭素研究提供借鉴。     

正交试验优化新型大孔吸附树脂分离葛根素的的工艺研究

[目的]优化大孔吸附树脂分离纯化葛根素的最佳工艺。[方法]用静态与动态吸附-解吸方法分离葛根素,用高效液相色谱测定葛根素的量。[结果]HPD-800树脂对葛根素分离效果最佳,分离纯化葛根素的最优工艺条件为：在吸附过程中,上样液浓度为0.2mg/ml,上样原液pH值为1.0,过柱流速为2.0ml/min;在洗脱过程中,乙醇洗脱剂的体积分数为70%,体积为5BV,过柱流速为1.5ml/min。该最优工艺条件下,葛根素收率最高达91.02%,产品仅经1次结晶纯度达96.13%。[结论]HPD-800大孔吸附树脂对葛根素的分离纯化效果良好,操作简单,生产周期短,有较高的工业生产应用价值。     

正交试验对密蒙花总黄酮分离纯化工艺的优化

优选密蒙花(Buddleja officinalis Maxim)总黄酮的分离纯化工艺条件。以总黄酮含量为指标,通过静态和动态试验确定较佳树脂,并通过单因素试验和正交试验优化密蒙花中总黄酮的分离纯化工艺。结果表明,采用AB-8型吸附树脂纯化效果较佳,其优化的密蒙花总黄酮分离纯化工艺为上样浓度2.24mg/m L,用3 BV 50%乙醇洗脱,洗脱流速为1.5 m L/min;处理后所得干膏中总黄酮的纯度为71.31%。其优选的工艺条件简单可行,可为工业化纯化密蒙花总黄酮提供参考。     

枯草杆菌重组水蛭素(HV3)的发酵工艺研究

［目的］确定芽孢杆菌发酵生产水蛭素的最佳工艺条件。［方法］以枯草芽孢杆菌为供试菌种,研究菌种活化时间、接种量、培养基装量、温度、初始pH值、碳源、氮源等对发酵的影响,在此基础上对发酵条件进行优化。［结果］最佳发酵条件为：温度37 ℃,初始pH值7,培养基装量20 ml/250 ml,菌种活化时间6 h,接种量3%,氮源为1.5%Tryptone,碳源为9.0%大豆浸出液,转速220r/min,16 h后添加0.3%Tween 80,发酵时间29 h。［结论］优化条件下,发酵液活性可达210 ATU/ml,较优化前提高13.1倍;优化条件上50 L罐放大后具有很好的重复性,发酵液活性可达208 ATU/ml。     

大孔树脂AB-8纯化麦冬多糖工艺的研究

[目的]研究大孔树脂纯化分离麦冬多糖的优化工艺条件。[方法]比较了不同pH值、流速对麦冬多糖的纯化效果。[结果]确定大孔树脂纯化麦冬多糖的层析条件为：上柱溶液pH值为8,洗脱溶液pH值为8,流速为1.0ml/min,在此条件下麦冬多糖纯度可达到81.0%,回收率71.2%。[结论]该优化工艺条件可以作为麦冬多糖的纯化方式进行推广。     

酒糟提取物菲汀制备植酸的工艺化研究

[目的]优化从酒糟提取物菲汀制备植酸的工艺条件.[方法]通过732#阳离子交换树脂及717#阴离子交换树脂吸附制备稀植酸.采用活性炭脱色,真空减压浓缩的方法制备精品植酸.[结果]制备植酸工艺条件:732#阳离子交换树脂的最佳流速为375 ml/h,最大选样量为0.5 ml;717#阴离子交换树脂的最佳流速为250 ml/h,最大选样量为0.5 ml.活性炭脱色的最佳条件为:0.5 ml/min,温度为60℃.真空减压浓缩的温度为50℃.[结论]研究确定了通过离子交换树脂法由酒糟提取物菲汀制备植酸的最佳工艺条件,可为工业化生产制备大量植酸提供重要的依据.     

HPLC测定万应跌打酒中东莨菪素的含量

［目的］建立万应跌打酒中东莨菪素的HPLC分析方法。[方法］采用Diamonsil C18（5 μm×250 mm×4.6 mm）色谱柱,以乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速为1.0 ml/min,检测波长为360nm,柱温为35 ℃。［结果］ 东莨菪素含量9.008-90.080（甲醇）μg/ml 范围内与其峰面积呈良好的线性关系,r＝0.999 9;平均回收率为98.83％（RSD＝1.18％）。10批万应跌打酒中东莨菪素的含量在0.03-0.12 mg/ml。［结论］该方法科学准确、操作简单、重复性好,可用于万应跌打酒的质量控制。     

枯草杆菌重组水蛭素的冷冻干燥工艺及热稳定性研究

[目的]研究枯草杆菌重组水蛭素的冷冻干燥优化工艺及在酸碱中的热稳定性。[方法]测定不同填充剂、保护剂浓度组合下的共熔点，根据共熔点最高的原则确定其组合浓度，据此再设计水蛭素的冷冻干燥工艺。[结果]优化的冷冻干燥工艺为：填充剂浓度4％，保护剂浓度1．2％，共熔点为-30℃，装样量为3．0ml，冷冻温度-40℃，冷冻时间2h，升华干燥温度-32℃，升华时间24h，再干燥温度25℃，时间5h，活力回收为96．2％，含水量为1．48％。100℃时，酸性条件下，水蛭素非常稳定；加热结合碱性的条件下水蛭素才相当不稳定。[结论]可为进一步工业化冷冻干燥水蛭素研究提供借鉴。     

DM130大孔吸附树脂富集葎草中总黄酮的工艺研究

[目的]研究DM130大孔吸附树脂纯化葎草总黄酮工艺并采用梯度洗脱HPLC法测定各洗脱组分中牡荆素、木犀草素和大波斯菊苷的含量。[方法]通过单因素分析考察DM130大孔吸附树脂分离、纯化葎草总黄酮的最佳工艺条件。HPLC检测波长为350 nm,流速1 ml/min,温度25℃,色谱柱为Hanbon Kromasil C_8色谱柱（250.0 mm×4.6 mm,5.0μm）,流动相A为水相（甲醇：水：甲酸=30：70：0.1）,流动相B为有机相（0.1%甲酸甲醇,即每100 ml甲醇含0.1 ml甲酸）。[结果]DM130树脂具体工艺条件为控制上样浓度0.2mg/ml,流速2.0 BV/h,上样液pH值为6,洗脱用水4.0 BV,50%乙醇共3.5 BV进行洗脱,洗脱流速2.0 BV/h;牡荆素进样浓度在0.16～20.00μg/ml,大波斯菊苷进样浓度在0.16～20.00μg/ml,木犀草素进样浓度在0.40～50.00μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。[结论]DM130型树脂在此工艺条件下,纯化葎草总黄酮效果良好,总黄酮回收率可达近88%,各洗脱组分中牡荆素、木犀草素、大波斯菊苷含量不同。     

大孔树脂分离纯化柞树叶总黄酮及其抗氧化活性研究

[目的]研究柞树叶总黄酮的纯化工艺及抗氧化活性.[方法]采用静态吸附与解析的方法,通过比较6种大孔树脂的吸附和解析性能,优选适宜的大孔树脂,并优化适合分离柞树叶总黄酮的解析条件.以VC为对照,对其还原力、DPPH自由基(DPPH·)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力进行研究.[结果]D101型大孔树脂纯化柞树叶总黄酮吸附与洗脱效果最好,其纯化最佳工艺条件为粗提液浓度0.55 mg/mL、上样流速1.5 mL/min、洗脱剂40％乙醇(V/V)、洗脱流速1.5 mL/min,柞树叶总黄酮纯度可达65.5％;分离纯化后柞树叶总黄酮具有良好的总还原能力以及清除DPPH自由基和抗超氧阴离子自由基活性,其总还原力大于VC的还原力,当质量浓度为0.03 mg/mL时,对DPPH自由基和抗超氧阴离子自由基的清除率分别为85.9％和65.9％.[结论]D101大孔树脂可用于柞树叶总黄酮的分离纯化,柞树叶总黄酮具有较强的抗氧化活性.     

费菜总黄酮分离纯化方法研究

[目的]开发高纯度费菜总黄酮的分离纯化工艺。[方法]以大孔树脂为载体,对上样量及层析条件进行优化,再进一步采用结晶的方法进行纯化。[结果]选用聚合物纳米微球PS RPC-300作为最佳层析填料,洗脱速度为5 m L/min,洗脱剂为70%乙醇,上样量为5.0 g/kg填料,结晶溶剂为丙酮;在此优化条件下所得产品的纯度为95.1%。[结论]此分离纯化方法简便可靠,分离效果好。     

超声提取离子色谱法测定茶叶浸出液中的氟化物

[目的]研究并优化茶叶的浸出方法,并在优化的浸出条件下采用离子色谱法测定茶叶浸出液中的氟含量。[方法]优化了离子色谱测量茶叶浸出液中氟化物的浸出方法。在Ionpac AS9-HC分离柱上用9 mmol/L Na2CO3淋洗液做流动相进行洗脱并进行测定。[结果]溶液中氟离子在0.02～5.00μg/g浓度范围内保持良好的线性关系,仪器检出限为1.5μg/L。试验方法对5种不同产地不同种类的茶叶回收率为97.62%～102.07%,精密度为1.01%～1.63%。安溪铁观音及云南普洱茶的氟化物含量比四川花茶和祁门红茶高,宜兴绿茶氟化物的含量最低,该法与国标氟离子选择电极法测量结果无显著性差异。试验研究的茶叶浸出液中氟含量均高于国家饮用水标准。[结论]离子色谱法对茶叶浸出液中氟化物的测定具有较好的应用价值,建议人们适量饮茶。     

人白细胞介素-12的纯化及鉴定

[目的]利用人白细胞介素-12(human interleukin 12,hIL-12)转基因马铃薯,探讨hIL-12的纯化条件。[方法]提取转基因马铃薯中的总蛋白,hIL-12的分离纯化步骤包括超滤、MKF-AIW阴离子交换层析、MKF-CIC阳离子交换层析。在阴离子交换层析吸附过程中采用试管法选择最佳吸附pH值,选择洗脱过程最佳洗脱pH值;选择阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值;ELISA法测定各纯化阶段收集的上清液或洗脱峰中的hIL-12的含量;非还原SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度;Western Blot检测纯化的hIL-12。[结果]阴离子交换层析吸附过程最佳吸附pH值为7.5,洗脱过程最佳洗脱pH值为7,阳离子交换层析洗脱过程最佳洗脱pH值为6.5。纯化的hIL-12经非还原SDS-PAGE分析蛋白纯度为91%。Western Blot分析结果表明,在40 kD处有特异的蛋白条带出现。[结论]hIL-12转基因马铃薯经总蛋白提取,超滤,阴离子交换层析,阳离子交换层析纯化,获得了高纯度的hIL-12。     

利用离子交换层析方法分离与纯化口蹄疫病毒抗原

[目的]利用离子交换层析方法分离与纯化口蹄疫病毒抗原。[方法]利用阴离子交换树脂制备高纯度的FMDV抗原,通过对样品及缓冲液pH、流速、缓冲液的盐浓度、样品上样体积等条件的摸索,确定最佳的FMDV抗原洗脱条件。[结果]当缓冲液pH为8.0、流速1.2 m L/min、盐浓度450 mmol/L、上样体积1.5 m L时,FMDV抗原的纯化效果最佳。[结论]该研究结果可为离子交换层析在FMDV抗原的分离与纯化提供依据。     

豆粕中大豆异黄酮提取工艺研究

[目的]探索从豆粕中提取大豆异黄酮的工艺条件。[方法]在单因素试验的基础上,采用L9（34）正交试验优化豆粕中异黄酮的提取工艺。[结果]豆粕异黄酮最佳提取工艺条件为：用体积分数为70%的乙醇水溶液,以20∶1（V/W,ml∶g）的液料比提取2 h,提取温度为75℃。[结论]优化的豆粕异黄酮提取工艺简便、合理,为异黄酮的分离纯化及生理活性的开发研究奠定了基础。     

草豆蔻有效成分的半制备型高效液相色谱分离

[目的]建立从草豆蔻中分离纯化4种主要有效成分半制备型高效液相色谱法。[方法]使用C18柱(250 mm×25.4 mm I.D.,10μm),考察了流动相的组成、流速和上样量对分离效果的影响,确定适宜的色谱条件;按制备型色谱条件进行洗脱,根据检测信号在线收集产品流出液,分离所得的馏分经HPLC法进行纯度检测。[结果]适宜的色谱条件是:流动相为甲醇-水梯度洗脱,流速为25 m L/min,上样量为232 mg,检测波长为300 nm。经过一次分离即可得到4种成分,经紫外光谱和核磁共振波谱鉴定4种成分分别为山姜素、松属素、小豆蔻明和桤木酮,经高效液相色谱检测纯度分别为98.7%、99.3%、98.4%和99.1%。[结论]与传统的分离方法相比,该方法具有高效、简便、快速的特点,适用于草豆蔻中主要有效成分的快速制备。     

杜仲籽粑的深度开发利用研究

[目的]研究从杜仲翅果中提取亚麻酸之后的籽粑中制备桃叶珊瑚苷及其苷元的工艺方法。[方法]采用硅胶柱层析法从杜仲粕中分离纯化桃叶珊瑚苷,优化柱层析分离、纯化条件,利用酶解技术选择最佳酶解条件,运用高效液相色谱法(HPLC)对产品进行检测分析。[结果]最佳上样量为2%,使用V(甲醇)∶V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)为4∶0.5∶9的混合溶剂进行洗脱,通过收集、重结晶可获纯度为97%的桃叶珊瑚苷产品,利用酶解技术在30 min时桃叶珊瑚苷能达到最佳的酶解效果。[结论]该研究为高效制备桃叶珊瑚苷及其苷元的工业生产提供依据。     

凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法同时检测葡萄中多菌灵和噻菌灵残留

[目的]建立同时检测葡萄中多菌灵和噻菌灵残留的高效液相色谱方法。[方法]用乙腈从葡萄样品中提取多菌灵和噻菌灵,提取物先用凝胶渗透色谱（GPC）净化,然后采用高效液相色谱法-荧光检测器测定,外标法定量。对样品前处理和色谱分离条件进行了研究和优化。[结果]2种杀菌剂在0.01～2.00μg/ml范围内线性良好,相关系数分别为0.9990和0.9996。添加2个浓度水平（0.1、0.4mg/kg）2种杀菌剂的在葡萄中的回收率均在90.3%～97.4%,相对标准偏差不大于2%。以3倍信噪比（S/N=3）确定该方法的检出限,多菌灵和噻菌灵分别为0.0035和0.0015mg/kg,均符合农药残留检测的常规要求。[结论]该方法简便、快速、净化效果较好,可同时满足葡萄中2种杀菌剂残留的检验工作需要。     

沙棘叶总黄酮分离纯化研究进展

通过查阅国内相关文献,概述沙棘叶中沙棘叶总黄酮的分离纯化方法.结果显示,沙棘叶总黄酮的分离纯化方法有X-5大孔吸附树脂纯化法、胺基吸附树脂纯化法、FL-1多功能吸附树脂纯化法、硅胶分离纯化法、硅胶G分离纯化法和Wakogel40C18硅胶层析柱分离纯化法.虽然已有不少沙棘叶总黄酮的分离纯化方法,但随着新药研发中对有效部位要求的提高,还需进一步优化沙棘叶总黄酮的分离纯化方法.