H4亚型家养水禽流感病毒分离株的表面膜蛋白基因的序列测定和遗传进化分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行4年多的监测，分离鉴定出多株H4亚型禽流感病毒。对其中的A／Duck／Yangzhou／216／2002（简称Dk／YZ／216／02）、A／Duck／Yangzhou／526／2003（简称Dk／YZ／526／03）、A／Duck／Yangzhou／36／2004（简称Dk／YZ／36／04）的血凝素基因和Dk／YZ／526／03、Dk／YZ／36／04的神经氨酸酶基因进行了克隆测序，并与GenBank中收录的其它序列进行了比较，遗传进化结果表明Dk／YZ／216／02的血凝素基因（HA）与毒株Tk／Minnesota／833／80（H4N2）同源性最高，而Dk／YZ／526／03和Dk／YZ／36／04的血凝素基因（HA）均与Budgerigar／Hokkaido／1／77（H4N6）同源性最高；而神经氨酸酶基因（NA）遗传进化分析结果表明Dk／YZ／36／04（H4N6）的NA基因与毒株Pigeon／Nanchang／8-142／2000（H3N6）同源性最高，而Dk／YZ／526／03（H4N2）的NA基因与Dk／Hokkaido／13／00（H9N2）同源性最高，3株禽流感病毒的HA推导的氨基酸剪切位点序列均为P-E-K-A-S-R，为典型低致病性禽流感病毒的特征序列，与对SPF鸡的致病力试验相吻合。     

鸭源H10亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析及其致病特性

采用血清学试验和RT-PCR方法从华东地区家养水禽中分离鉴定出多株H10亚型禽流感病毒，对其中1株A／Duck／Yangzhou／502／2003（简称Dk／YZ／502／03）的血凝素（HA）基因进行了序列测定，并与GenBank中登录的其他序列进行了比较。结果显示，Dk／YZ／502／03株血凝素基因与哺乳动物水貂分离株A／Mink／Sweden／84（H10N4）的同源性最高；其推导的氨基酸剪切位点序列为P-E-I-M-Q-G-R，为典型低致病性禽流感病毒的特征序列，这与该毒株对SPF鸡和BALB／c小鼠的低致病特性相吻合。     

鸭源H5N1亚型禽流感病毒分离株的致病性及表面蛋白基因序列分析

分析1株2004年从广东省分离获得的H5N1型禽流感病毒株A/Duck/GuangdongJiedong/23/2004对SPF鸡和鸭的致病性,并对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行测定,与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果,此分离株对SPF鸡和鸭均具有高致病性,且致死率达100%。HA基因与SCK/ST/475/04的同源率最高,而NA基因与Ck/GD/178/04同源率最高。进化分析结果表明,此毒珠与DK/Ch i-na/E319-2/03的HA、NA亲缘关系较近,推测它们来源于同一祖代毒株。推导的HA基因氨基酸裂解位点为-RRRKK-,具有典型高致病性禽流感的特征序列;NA基因颈部49~68位20个氨基酸缺失是近年来H5N1亚型优势流行株共同的遗传标志。     

Clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感疫苗候选株的构建

2015年秋季以来,clade2.3.4.4的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)分离率逐渐增加,成为我国华东地区流行的优势毒株。经遗传进化分析发现,与抗原性相关的血凝素(HA)氨基酸呈现出一定规律的进化趋势,导致抗原性发生变化。研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8)AIV为内部基因供体,以clade2.3.4.4中的H5N2亚型毒株A/chicken/Yangzhou/YZ1111/2015(YZ1111)的表面抗原HA和神经氨酸酶(NA)为外部基因供体,并删除YZ1111株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,通过反向遗传操作,成功拯救出1株重组病毒r YZ1111。r YZ1111在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡胚和鸡均无致病性。表明在分析H5N2亚型AIV抗原变异的基础上研发出疫苗候选株,为防控变异的clade2.3.4.4 H5N2亚型禽流感提供了备选疫苗。     

1株H1亚型水禽流感病毒分离株的致病特性和表面膜蛋白基因的序列分析

采用常规血清学试验和特异性RT-PCR方法,对我国华东地区家养水禽流感病毒进行了长达4年的跟踪监测,分离到多株H1亚型禽流感病毒,并对其中的1株A/Duck/Yangzhou/163/2003(简称Dk/YZ/163/03)的血凝素基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果发现,Dk/YZ/163/03的血凝素基因(HA)与禽流感日本分离株A/Japan/91(H1)的同源性最高;而神经氨酸酶基因(NA)与Mallard dk/A1b/35/1976(H1N1)同源性最高;其推导的氨基酸剪切位点序列为P-S-I-Q-S-R,是典型低致病性禽流感病毒的特征序列,这与该毒株对SPF鸡和BALB/c小鼠的低致病特性相吻合。     

鸭源H5N1亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及其HA和NA基因的生物信息分析

分离到1株 H5N1亚型高致病性禽流感病毒, 经序列测定发现HA蛋白裂解位点上插入多个连续的碱性氨基酸（PQREIRRKKR*G）,从分子上证实是一株高致病性禽流感病毒。核酸序列比较分析结果表明,分离的流感病毒HA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.8%;NA基因与A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1) 和A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达到98.7%。氨基酸水平上,HA与A/duck/Viet Nam/Ncvd1/2002(H5N1)同源率最高,可达99.3%;NA与A/chicken/Jiangsu/cz1/2002(H5N1)同源率最高,达98.7%。HA与NA基因的潜在糖基化位点与作者所选参比毒株一致。通过遗传进化树分析结果表明,A/duck/VietNam/Ncvd1/2002(H5N1)可能是该毒株的来源株。     

禽流感病毒A／Turkey／Canada／63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒（AIV）A／Turkey／Canada／63毒株，提取病毒基因组总RNA，应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段，并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明，该毒株的HA基因全长为1745bp，含有完整的阅读框架，编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp，编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示，该毒株HA基因属于H6亚型，NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析，表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80．5％～87．3％，氨基酸的同源性为88．0％～93．1％；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86．0％～93．5％，氨基酸的同源性为90．6％～96．3％。     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况，本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒，命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6），对其HA和NA基因进行序列测定，并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示，分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%），NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF，符合低致病性禽流感病毒分子特征；与部分N6亚型禽流感病毒一样，分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外，本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定，结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2，3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。     

一株鸭源H11N3亚型禽流感病毒的遗传进化分析及对小鼠的致病性研究

为了解H11N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性，本研究对2020年在福州市某活禽市场鸭中分离的一株H11N3亚型AIV进行了全基因组测序、遗传进化分析和对BALB/c小鼠的致病性试验。测序结果显示，分离株HA裂解位点为PAIASR↓GLF，符合低致病性AIV分子特征；HA蛋白²²⁶L和²²⁸S突变显示病毒具有结合人源受体(SAα-2,6 Gal)的特征性氨基酸。PB1、PA、NP和M1蛋白均出现对哺乳动物致病性增强的特征性氨基酸。遗传进化分析显示，H11N3 AIV的8个基因节段均属于欧亚分支，其HA基因与A/duck/Fujian/SD061/2017 (H11N3)株HA基因序列相似性最高，而NA基因与A/EN/Fujian/02754/2016 (H3N3)株NA基因序列相似性最高。该病毒内部基因分别与浙江、福建和云南等地鸭和鸡体内分离的H7N9、H7N7、H1N2、H7N2、H7N7和H9N6等亚型AIV相关基因高度同源。小鼠致病性试验结果显示，该病毒未经适应即可在小鼠鼻甲和肺脏中高效复制，表明该病毒株具备感染哺乳动物的能力。上...     

A／African Startling／England—Q／983／79（H7N1）与我国HTN2亚型禽流感病毒分离株的比较

本研究通过反转录-聚合酶链式反应（ILT-PCR）技术分别扩增了禽流感病毒A/African Starfling／England-Q／983／79（A．S／E．Q）（H7N1）的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA基因，将其分别克隆到PMD18-T载体后进行序列测定；并将克隆到的8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较分析。结果表明所克窿到的8个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架；HA、NA基因的序列分析表明A．S／E．Q符合低致病力禽流感病毒的特征；与我国H7N2亚型AIV分离株A／chicken／Hebei／1／02的序列比较发现。A／chicken／Hebei／1／02的HA、M、NP、PB1、队基因与A．S／E．Q同源性最高，说明我国北部分离的AIV起源于A．S／E．Q。     

昆虫抗真菌肽Thanatin-CAD双价基因的合成、克隆及其表达

为促进昆虫抗菌肽基因在转基因抗病育种和生物工程制药的应用,通过设计嵌合引物结合分段PCR的方法将抗真菌肽Thanatin基因与Cecropin AD基因(CAD基因)融合拼接为Thanatin-CAD双价基因,采用T-A克隆法将其克隆至pGEM-T Easy载体,进行测序,结果证实与预期设计的完全一致;然后再将其亚克隆至表达载体pET-21d中,用IPTG诱导含重组表达质粒的菌株,对表达产物进行生物活性测定,初步结果显示Thanatin-CAD双价基因的融合表达产物对受试细菌无抑菌活性,但对部分病原真菌有较强的抑菌作用。     

鸡传染性支气管炎M41毒株S1基因的克隆与真核表达研究

根据Genbank中公布的IBVS1基因序列 ,设计了一对引物 ,克隆出IBV强毒株M41的S1基因 ,基因大小为 1 .62kb ,导入真核表达载体系统pIRS1neo中 ,表达蛋白分子量为 61ku ,并具有中和活性。为今后开发鸡传染性支气管炎基因工程疫苗奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎X毒株S1基因的克隆与真核表达

根据GenBank中报道的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因序列，设计了1对引物，克隆了IBV强毒株X的S1基因，基因大小为1．62kb。将其导入真核表达载体系统pIRES1neo中，表达蛋白为61000。     

鹅脂肪甘油三酯脂肪酶和长链脂酰辅酶A合成酶1基因表达差异及其对脂肪沉积和血清脂类代谢的调控

本试验旨在研究脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和长链脂酰辅酶A合成酶1(ACSL1)基因在鹅的不同组织器官中的表达差异,并探索2个基因表达对机体脂肪沉积和血清脂类代谢的调控。选取16周龄五龙鹅30只(公母各占1/2),屠宰后用实时荧光定量PCR检测不同组织器官(肝脏、心脏、皮下脂肪、腹部脂肪、胸肌、腿肌、肌胃、腺胃、小肠、肾脏、大脑、肺、脾脏)中A TG L、A CSL1基因表达量。结果表明:1)在鹅的皮下脂肪、腹部脂肪、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸肌和腿肌中均检测出ATGL和ACSL1基因的表达;ATGL基因在皮下脂肪和腹部脂肪中表达量最高,其次是肝脏和脾脏,在肾脏、心脏、胸肌和腿肌中只有少量表达;ACSL1基因在皮下脂肪、腹部脂肪、肝脏、脾脏中表达量较高,在肾脏、心脏、胸肌和腿肌中有少量表达,而在肌胃、腺胃和肺中几乎不表达。2)ATGL基因表达量与腿肌肌内脂肪率、胸肌肌内脂肪率、腹部脂肪率、胸肌率和腿肌率呈显著或极显著负相关(P0.05或P0.01),与皮下脂肪率呈显著正相关(P0.05);ACSL1基因表达量与腿肌肌内脂肪率、胸肌肌内脂肪率、胸肌率呈正相关(P0.05),与腿肌率呈显著正相关(P0.05),与皮下脂肪率呈显著负相关(P0.05)。3)ATGL基因表达量与血清甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和葡萄糖含量呈显著或极显著正相关(P0.05或P0.01);ACSL1基因表达量与血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和葡萄糖含量呈负相关(P0.05),与甘油三酯含量呈显著负相关(P0.05)。由此可见,ATGL和ACSL1基因在鹅的不同组织器官中的表达具有明显差异性,对机体脂肪沉积和血清脂类代谢具有反向调控作用。     

禽类干扰素及其基因工程研究进展

干扰素是由干扰素诱生剂诱导生物细胞所产生的一类高活性多功能的糖蛋白。干扰素自被发现以来,由于其广谱抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视,在其基因结构、作用机理以及体外重组表达等方面都取得了巨大突破。作者综述了干扰素的基因结构、基因工程及重组干扰素的应用研究进展。     

干扰素的分子生物学研究进展

干扰素是一类多功能细胞因子，是由哺乳动物体细胞合成与分泌的潜在的生物活性蛋白质，具有抵抗病毒感染、抑制肿瘤细胞生长与调节机体免疫功能的作用，其基因表达受多种因素和调控元件的调节。干扰素基因工程和基因治疗研究引起了广泛的关注，目前已被应用于临床治疗。     

犬瘟热病毒小熊猫株H、F和N基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒（CDV）的核苷酸序列，设计并合成了扩增CDVH、F和N基因的3对引物，经RT—PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株（LP株）H、F和N基因，并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明，CDV LP株属于强毒谱系，与CDV流行株的亲缘关系近．H基因含有较多潜在的糖基化位点．F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达栽体pVAX1的CMV启动子下游，构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN，体外转染BHK-21细胞．用间接ELISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠，从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体．初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答。     

猪源大肠杆菌floR、CTX-M、mcr-1耐药基因多重PCR检测方法的建立

为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。     

陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒S、M和N基因的遗传变异分析

为了解陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传和变异情况,采集陕西省部分地区规模化猪场的5份疑似PEDV感染的猪小肠内容物,进行PEDV S、M和N基因的RT-PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定和遗传变异分析。结果表明,5份病料均能扩增出PEDV S、M和N基因,5株病毒分别命名为SXSL、SX-BJ、SX-YL、SX-WN和SX-HZ株。序列分析表明,5株毒株之间的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为96.7%~99.8%、98.4%~100%和97.2%~99.9%;氨基酸序列的同源性分别为97.4%~99.9%、98.2%~100%和98.2%~100%。该5株病毒与中国疫苗株CV777的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为93.9%~99.8%、98.1%~100%和95.3%~99.9%,氨基酸序列的同源性为93.6%~99.9%、96.2%~100%和98.2%~100%。遗传进化分析结果显示,5个陕西分离株的S基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远,与近年来中国株、日本株以及韩国株亲缘关系较近。SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较近,且与中国株CHGD-01亲缘关系密切。SX-WN株和SX-HZ株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远。该5株病毒的S基因以及SX-WN株和SX-HZ株的M基因和N基因变异程度较大,而SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株三个流行株均与中国株CHGD-01亲缘关系密切,并且与近年在陕西省流行的PEDV也不完全相同。     

4株鸡肾型IBV陕西分离株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

采用RT—PCR方法对近年来本实验室分离的4株肾型IBV陕西分离株的纤突蛋白S1基因、膜蛋白基因（M）和核蛋白基因（N）分别进行扩增,测序后进行遗传变异分析。结果显示：与肾型疫苗株w93相比,各分离株S1基因均存在广泛的点突变,并且都存在基因插入现象,分离株之间氨基酸同源性为75．8％～99．4％;M基因除了存在点突变外,W09和WNl2在其5’端还存在9个核苷酸的缺失,分离株之间氨基酸同源性为91．0％～99．6％;N基N无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为99．3％～99．5％。4株IBV分离株在S1、M和N基因氨基酸系统进化树上分属于不同的进化群,且都与较早的肾型IBV陕西分离株w118遗传距离较远。结果表明,4株鸡肾型IBV流行毒株的s1、M和N基因均存在不同程度变异,这可能是免疫鸡群肾型鸡传染性支气管炎长期流行的主要原因．