犬链球菌保护性抗原的鉴定

为克隆、表达犬链球菌(S.canis)保护性抗原基因,并对其表达产物进行免疫原性分析.本研究以Lambda ZAP Ⅱ载体构建了S.canis的3 kb～8 kb随机基因组文库,通过S.canis阳性血清筛选和质粒拯救,获得一株阳性克隆重组质粒并进行了序列测定.通过BLAST分析并与GenBank中登录的相近基因序列比较发现,该基因为S.canis的1个保护性抗原(SPASc)基因,该基因与兽疫链球菌和产脓链球菌的保护性抗原及马链球菌M蛋白基因具有一定的同源性.根据该序列设计特异性引物,经PCR扩增、克隆并进行了SPASc基因的原核表达.用纯化SPASc重组蛋白免疫兔制备的血清对小鼠具有保护性作用.     

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析

将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收０．９５ｋｂα毒素基因片段,再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析,证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列,并证明其具有正确的阅读框架。     

比格犬SLAM基因的克隆与序列分析

对比格犬的犬瘟热病毒细胞受体——信号淋巴细胞激活因子(SLAM)基因进行克隆及测序分析,并与其他物种的SLAM受体进行比较,以期发现其关键结构部分.用RT-PCR从Con A刺激后的犬外周血淋巴细胞中扩增SLAM基因,将目的片段连接到PMD18-T载体上,转化感受态细胞,筛选阳性克隆,测序.结果显示,克隆的比格犬SLA...     

犬γ干扰素基因的克隆与序列分析

根据已发表的犬γ干扰素（Ｃａ－ＩＦＮ－ｒ）ｃＤＮＡ序列设计引物,用植物血凝素（ＰＨＡ）有机锗（Ｇｅ－１３２）刺激体外培养的犬脾细胞产生ＩＦＮ,提取ＩＦＮｍＲＮＡ,并以其为模板进行返转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出４８０ｂｐ基因片段。经酶切鉴定后将其克隆到ｐＵＣ１９的ＳｍａⅠ,构建重组质粒ｐＵＣ．ＩＦＮ。经酶切、ＰＣＲ及序列分析鉴定,可证明克隆的基因为犬γ干扰素,与所发表的核苷酸序列同源率为９     

犬白细胞介素18基因的克隆与序列分析

为研究犬白细胞介素18(IL-18)的生物学功能,从犬外周血中分离白细胞,经Con A刺激后,提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增犬IL-18基因,连接pMD19-T simple vector,转化DH5α感受态细胞,经双酶切鉴定,获得阳性重组质粒后进行序列分析。结果表明,获得的犬IL-18基因全长为582bp,编码氨基酸194个。将犬与GenBank中牛、猫、羊、猪、鼠、兔、狐、貉IL-18基因进行同源性比较,发现犬IL-18与红狐和貉IL-18的同源性最高,氨基酸序列同源性分别达96.4%、91.2%,与其他物种则存在较大种属差异。     

蛔虫抗原基因ALAg克隆及序列分析

为了确定蛔虫基因工程疫苗的候选基因,试验以蛔虫幼虫的RNA为模板,利用RT - PCR方法扩增出ALAg基因,扩增产物克隆到pMD18 -T载体,筛选阳性克隆测序并进行Blast分析.结果表明:该基因与GenBank公布的猪蛔虫As37抗原基因(AB078971)的同源性为95％,与西式贝蛔虫Ag3抗原基因(EU927...     

蛔虫抗原基因ALAg克隆及序列分析

为了确定蛔虫基因工程疫苗的候选基因,试验以蛔虫幼虫的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出ALAg基因,扩增产物克隆到pMD18-T载体,筛选阳性克隆测序并进行Blast分析。结果表明:该基因与GenBank公布的猪蛔虫As37抗原基因(AB078971)的同源性为95%,与西式贝蛔虫Ag3抗原基因(EU927450)的同源性为92%。说明ALAg基因是线虫特有的抗原基因。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

犬IFN-α1基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素进行研究,试验采用PCR法将犬IFN - αl基因从基因组DNA克隆到pGEM -T载体,并进行测序分析.结果表明:犬IFN - αl基因ORF大小为564 bp,编码187个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白理论分子质量为19 ku,等电点为6.217,有4个潜在磷酸化位点、1个N糖基化位点和4个半胱氨酸...     

犬IFN-α1基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素进行研究,试验采用PCR法将犬IFN-α1基因从基因组DNA克隆到pGEM-T载体,并进行测序分析。结果表明:犬IFN-α1基因ORF大小为564 bp,编码187个氨基酸,前23个为信号肽;成熟蛋白理论分子质量为19 ku,等电点为6.217,有4个潜在磷酸化位点1、个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区;经二级、三级结构预测,该蛋白主要由5段α螺旋组成;犬IFN-α1基因与貉子、赤狐的同源性最高,为98%,在进化树中处于同一分支;在干扰素多肽链中,15L、18L、77W、96L9、9C1、24F、131L、137S、140AWE1421、45R和150R在所有分析物种中高度保守。     

堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因的克隆和序列分析

卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓｃａｌｍｅｔｅ－ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）是一种活的减毒性结核菌苗。目前,国内外科学家正致力于运用基因重组技术,将ＢＣＧ发展成一种新型重组活载体疫苗［１,２］。本研究对堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因进行了ＰＣＲ扩增、克隆和序列分析,...     

奶牛无乳链球菌内蒙古分离株SIP基因的克隆与序列分析

试验根据GenBank 公布的牛源无乳链球菌SIP基因序列设计并合成1对引物,通过PCR 扩增获得SIP基因部分扩增产物.序列分析结果表明:SIP基因扩增产物大小为945 bp,编码315个氨基酸残基.标准菌株(+株)与内蒙古分离株(M株)的基因及氨基酸同源性为100%,这2个菌株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株(DQ914274)SIP基因及氨基酸同源性达到98.94%及99.68%.     

停乳链球菌内蒙分离株抗原基因MIG的克隆

停乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,根据GenBank中登陆的停乳链球菌表面蛋白MIG基因序列,设计一对引物,采用PCR的方法从临床分离的停乳链球菌内蒙分离株基因组DNA中扩增出MIG基因,得到一条1900bp的片段。将其连入PMD-19T载体中,经酶切,PCR及序列测定法进行鉴定。经DNA测序分析,证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因(AF354651)序列同源性为95%,具有高度保守性。     

犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

为了研究犬粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用,试验根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)GM-CSF cDNA基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬GM-CSF基因.结果表明:扩增片段长为435 bp,编码144...     

犬GM-CSF基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

为了研究犬粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的作用,试验根据GenBank上发表的犬(Canis familiaris)GM-CSF cDNA基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出犬GM-CSF基因。结果表明:扩增片段长为435 bp,编码144个氨基酸;生物软件分析结果表明,该序列与猕猴的亲源性更近,与已知人、马、牛、野猪、豹猫、鸡等序列的同源性较低。     

犬弓首蛔虫ITS1基因的克隆及序列分析

通过对国内5个犬弓首蛔虫株(T.canis)即GD株、CQ株、YN株、HN株和GZ株的rDNA的内转录间隔区Ⅰ(ITS1)序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在确定ITS1是否可作为T.canis分子分类的遗传标记。结果显示:GD株、CQ株、YN株、HN株和GZ株的ITS1序列基本一致,仅GD株有2个碱基的差异,HN株和GY株分别有1个碱基的差异;与GenBank中登录的T.canis(序列号为AB110024、AB110026)的ITS1序列同源性高达98.9%～99.4%。结果表明ITS1可作为分子标记用于T.canis与其它蛔虫的种间鉴定,但不适合用于T.canis种内遗传变异的研究,为进一步的分子遗传学和分子诊断学研究奠定基础。     

RHDVCD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDVCD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDVVP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％,与其它毒株的同源性在92．0％～96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi—co-89株同源性最高为99．4％,与其它毒株的同源性在96．6％N98-3％之间。     

野猪生长激素基因的克隆与序列分析

参考家猪GH基因序列[M17704.1],设计1对特异引物,用PCR方法从野猪基因组中扩增出1条长约1.8kb的DNA片段。PCR产物经PMD18-TVector载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。结果表明:野猪生长激素基因DNA序列长1792bp,含完整的5个外显子和4个内含子,与家猪、牛、山羊、河马、狗、小鼠和恒河猴的GH基因cDNA序列同源性分别为99.19%、89.6%、89.7%、94.6%、92.9%、86.9%、77.3%。其cDNA所编码氨基酸与牛、山羊、河马、狗、小鼠和恒河猴同源性分别为98.74%、83.9%、83.9%、92.5%、90.7%、81.6%、65.5%。所测野猪生长激素基因序列与13个家猪品种的GH基因序列比较,检出54个核苷酸变异位点(外显子12个,内含子36个,侧翼区6个),其中24个为各家猪品种内所不具有的新变异位点,即野猪种群特有变异位点。在外显子的12个变异位点中,有8个可导致氨基酸残基的改变。这些结果,表明了野猪GH基因在进化过程中的保守性和多态性。     

基因外显子2的克隆与序列分析

 本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

貉GAPDH基因的克隆与序列分析

根据哺乳动物的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glycera ldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)氨基酸的保守序列,参考犬的GAPDH基因序列,设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术,从貉的肝脏中扩增出一段长271 bp的序列。对其序列分析表明:该基因序列与GenBank中已发表的犬的GAPDH基因(GenBank序列号:AB028142,AB038240)同源性为100%。本试验成功地克隆了一段貉GAPDH基因,证实了貉亦存在GAPDH基因且高度保守。