转基因鸡及输卵管生物反应器

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡输卵管生物反应器正逐渐成为人们关注的焦点,转基因鸡以其卓越的优势必将成为科学研究的热点和生物制药领域的新兴产业之一。目前,转基因鸡最成功的制备方法即逆转录病毒介导法,并已成功制备出表达标记基因的转基因鸡。通过综述鸡作为生物反应器的优势、转基因鸡发展历程、逆转录病毒载体制备转基因鸡的方法过程和转基因鸡的研究进展,同时也讨论了转基因鸡的意义和可能存在问题。     

逆转录病毒转染胚盘细胞制备嵌合体鸡胚的研究

 【目的】通过重组逆转录病毒体内感染源于第X期胚盘细胞的方法获得嵌合体鸡。【方法】将扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的开放阅读框插入逆转录病毒表达载体pour-pBabe中获得重组逆转录表达载体;采用磷酸钙转染法将其与包装载体pVSVG共转入293 10A1包装细胞中进行病毒包装,得到病毒原液经超速离心浓缩200倍后注入种蛋(第X期)胚盘下腔,孵化种蛋。提取孵化5.5天的鸡胚基因组DNA,进行PCR检测和Southern杂交检测。【结果】构建含EGFP完整开放阅读框的逆转录病毒表达载体pour-pBabe-EGFP,提取孵化5.5 d鸡胚基因组DNA,经PCR、Southern杂交检测,嵌合体阳性率分别为75%和66.7%。【结论】通过用重组逆转录病毒体内感染鸡胚盘细胞的方法可获得嵌合体鸡。     

转基因鸡制备技术研究进展

本文综述了转基因鸡的研究及应用,并介绍了3种常用的制备方法,包括外源基因受精卵注射、逆转录病毒介导转基因、利用慢病毒载体实现转基因的介入和导向,以期为转基因技术的应用提供参考。     

塞北乌骨鸡和罗曼鸡种蛋孵化性能的比较研究

目的比较研究塞北乌骨鸡和罗曼鸡种蛋的孵化性能,为塞北乌骨鸡系统化选育提供可借鉴的方向．方法分别选取塞北乌骨鸡种蛋和罗曼鸡种蛋5000枚,按种蛋保存的不同时间（3d、6d、9d、12d、15d）,各分为五组,研究两个品种鸡种蛋在孵化过程中的失重率以及不同保存时间对失重率和孵化率的影响．结果塞北乌骨鸡胚蛋在孵化过程中失重率均大于罗曼鸡（p〈0．05）;塞北乌骨鸡不同保存时间（3d、6d、9d、12d、15d）种蛋失重率、18龄胚胎失重率、孵化率均大于罗曼鸡（p〈0．05）;塞北乌骨鸡种蛋保存时间15d,出雏时间推迟,罗曼鸡种蛋保存时间12d,出雏时间推迟;种蛋不同保存时间对雏鸡重无影响．结论塞北乌骨鸡种蛋保存时间比罗曼鸡长,但种蛋失重率、胚胎失重率、受精蛋孵化率相对较低,在以后的选育过程中需加强失重率和孵化率方面的选育．     

鸡卵清蛋白基因调控序列指导人促红细胞生成素转基因鸡的制备

本研究将鸡卵清蛋白5端调控区调控人促红细胞生成素的pOV-hEPO特异表达载体用脂质体包埋，和供体细胞融合后，显微注射入450枚受体胚盘，采用代用蛋壳法培养制备转基因鸡，PCR和斑点杂交检测外源基因已整合入早期鸡胚胎生殖系统，为制备表达人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应器奠定了基础。     

狼山鸡-AA肉鸡嵌合体的制作及其转基因鸡研究

试验Ⅰ:以狼山鸡为供体,AA肉鸡为受体,通过赤道开窗法制作了狼山鸡-AA肉鸡的嵌合体.共操作了108枚鸡蛋,孵化成活19只,孵化成活率17.6%.获得表型嵌合体鸡胚22枚,其中15只孵化成活,嵌合体率为13.9%.对2只嵌合体公鸡解剖发现,有1只的睾丸发育异常.PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,2只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞.结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因鸡是可行的.试验Ⅱ:利用脂质体介导法,在体外将外源pEGFP质粒转入到鸡X期胚胎细胞中,培养8 h开始有外源基因的表达,体外培养12 h后获得了21.43%的转染效率.将转染后的鸡胚盘细胞移入到受体AA肉鸡的胚下腔,孵化6 d后在8个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为40%(8/20).     

狼山鸡-AA肉鸡嵌合体的制作及其转基因鸡研究

试验Ⅰ:以狼山鸡为供体,AA肉鸡为受体,通过赤道开窗法制作了狼山鸡-AA肉鸡的嵌合体.共操作了108枚鸡蛋,孵化成活19只,孵化成活率17.6%.获得表型嵌合体鸡胚22枚,其中15只孵化成活,嵌合体率为13.9%.对2只嵌合体公鸡解剖发现,有1只的睾丸发育异常.PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,2只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞.结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因鸡是可行的.试验Ⅱ:利用脂质体介导法,在体外将外源pEGFP质粒转入到鸡X期胚胎细胞中,培养8 h开始有外源基因的表达,体外培养12 h后获得了21.43%的转染效率.将转染后的鸡胚盘细胞移入到受体AA肉鸡的胚下腔,孵化6 d后在8个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为40%(8/20).     

慢病毒载体介导外源基因在不同细胞及鸡体不同组织中的表达

以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为标记基因构建复制缺陷型慢病毒载体生产病毒,以病毒感染不同来源、不同分化特征的细胞,并进行鸡囊胚注射,观测外源基因的表达情况。试验结果表明,在所有类型细胞中均可检测到EGFP较高水平的表达,其中在HeLa、293FT细胞中的转染效率约1×10^8TU·mL^-1（TU：转染单位）,在C127细胞中为5×10^7TU·mL^-1,在鸡胚胎成纤维细胞（CEF）中约为1×10^6TU·mL^-1,病毒在鸡原生殖细胞（cPGC）中转染效率最低为1×10^2TU·mL^-1。病毒的感染可引起细胞表型的不利改变。用该病毒载体注射鸡囊胚获得了可直接活体观察绿色荧光信号的转基因鸡,转基因效率约53％;外源基因在鸡体不同组织如表皮、消化道等器官中检测到不同水平的表达,并表现出不同的分布特征。     

鸡白痢病的诊治

本病是由鸡白痢沙门氏杆菌引起雏鸡的一种常见传染病，根据临床的观察，雏鸡的发病率和死亡率较高．但是在成年鸡的发病过程中都为慢性或隐性经过。雏鸡在孵化过程中，带菌的种蛋，可以使部分胚胎死亡，以致降低孵化率：孵化出的雏鸡，可能没有明显症状，就立即死亡；也可能呈昏睡、衰弱和食欲消失的症状，不久后死亡；     

转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化

 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CD144和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。     

Germline transmission of exogenous genes in the chicken

Difficulties associated with in vitro manipulation and culture of the early chicken embryo have restricted generation of transgenic chickens to approaches that use replication-competent retroviruses. The need to produce transgenic chickens in the absence of replicating virus prompted development of a new method of gene transfer into the chicken. Microinjection of the replication-defective reticuloendotheliosis virus (REV) vector ME111 beneath unincubated chicken embryo blastoderms results in infection of germline stem cells. This vector contains genetic information exogenous to the chicken genome, including both the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase gene and the Tn5 neomycin phosphotransferase gene. About 8 percent of male birds hatched from injected embryos contained vector DNA in their semen. All four positive males tested passed vector sequences onto their progeny. Analysis of G1 offspring showed that gonads of G0 male birds were mosaic with respect to insertion of vector provirus. Thus, primordial germ cells present in the unincubated chicken embryo blastoderm are susceptible to infection by defective REV vectors.     

番茄BADH2基因转化水稻

用分子生物学手段,构建含番茄BADH2基因的过表达载体,通过农杆菌介导的方法将其导入日本晴幼胚诱导的愈伤组织,获得了303块潮霉素(Hm)抗性愈伤组织。获得1 059个转化植株。随机选择115个T0植株进行Hyp离体叶片筛选,结果表明,绝大多数植株均呈抗性,并且与PCR检测结果相吻合,说明T0植株中不存在假阳性。     

转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性

将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzae)编码harpinxoo的hrfAxoo基因连接到双元载体pBI121上，构建成含hrfAxoo基因的植物表达质粒pBMH9。以粳稻R109成熟胚诱导愈伤组织，由根癌农杆菌EHA105介导，将含有hrfAxoo基因的重组质粒pBMH9转化水稻愈伤组织。用G-418抗生素做抗性筛选，产生抗性愈伤组织的频率为85％，转化植株的再生频率为53％。根据hrfAxoo基因两端序列和pBMH9中外源片断的旁侧序列设计2对引物，通过PCR扩增验证转化水稻中的靶基因序列。对部分转基因水稻进行RT—PCR和Northern blot分析，结果显示hrfAxoo基因在转基因水稻中能正常表达。抗病性鉴定结果表明，转基因水稻在，ID、T1和T2代对水稻白叶枯病有较好的抗性；在转基因系中水稻白叶枯病菌的生长明显受到抑制。因此，本研究获得对水稻白叶枯病抗性提高的转基因水稻。     

鸡α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2亚型病毒(AIV H9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。【结果】成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kD,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和IBDV活性明显高于单一rChIFN-α的抗病毒活性;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。IFN-α活性单位为200IU的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡和胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。合适剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性。【结论】rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性,这为进一步研究以rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。     

转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究

【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor 基因标记的K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】（1）Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。（2）羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。（3）来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。（4）以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。（5）对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9 毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。     

基因枪介导转hpa99基因小麦的获得和检测

为了探究来源于水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的hpa99基因改良小麦抗赤霉病的可行性,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)作为选择标记,通过基因枪法将带有hpa99基因的表达质粒AF234296导入普通小麦品种山农15。2～3次PMI筛选后,获得38株再生植株。通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色以及PMI基因和目的基因hpa99的PCR检测,获得7株阳性植株,转化率为0.108%。结果表明,hpa99已整合到小麦基因组中,获得了无抗生素标记基因的转基因小麦。     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

鸡干扰素调节因子7的分子特征及其组织表达特性分析

【目的】明确鸡干扰素调节因子7 （chIRF7）的分子特征及chIRF7基因在不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展IRF7基因调控鸡相关组织发育和抗病毒研究打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增chIRF7基因编码区（CDS）并构建其重组真核表达载体,通过SOPMA、SWISS-MODEL及BioEdit等在线软件预测分析chIRF7蛋白的二、三级结构及结构域保守性;以重组真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞系（DF-1）,观察融合蛋白的亚细胞定位情况及分析过表达融合蛋白对新城疫病毒（NDV）复制的影响;采用实时荧光定量PCR检测chIRF7基因在鸡胚发育第14 d（E14d）及鸡出壳第1 d（H1d）、第7 d（H7d）和第14 d（H14d）不同组织中的表达情况。【结果】将从鸡外周血淋巴细胞中扩增获得的chIRF7基因CDS序列插入真核表达载体pEGFP-C1的酶切位点即成功构建获得重组真核表达载体pEGFP-chIRF7。chIRF7蛋白二级结构由无规则卷曲（占51.12%）、α-螺旋（占26.48%）、延伸链（占16.70%）和β-转角（占5.70%）组成;鸡与其他禽类、人类和哺乳动物的IRF7氨基酸序列相似性均较低,且5个功能结构域不保守。经聚肌胞苷酸［Poly （I:C）］或NDV处理DF-1细胞后,可使融合蛋白EGFP-chIRF7由细胞质定位转变为细胞核定位;而在细胞内过表达融合蛋白EGFP-chIRF7可降低NDV的复制能力和细胞致病性。chIRF7基因在鸡不同发育阶段各组织中均有不同程度的表达,且以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和腺胃,在腿肌中的相对表达量较低;从E14d发育到H14d,chIRF7基因在肺脏中的表达呈先下降后趋于稳定的变化趋势,在肝脏、腺胃、心脏和腿肌中呈先下降后上升再下降的变化趋势,在脑组织中呈先稳定再下降的变化趋势,在胸肌和眼球中的表达则趋于稳定。【结论】 IRF7在不同物种中的相似性较低且结构域不保守,经外界刺激诱导表达的chIRF7会发生细胞核移位而具有抗病毒感染效果。IRF7基因在鸡不同发育阶段的肺脏、肝脏和腺胃中高表达,说明对这3个组织的发育可能具有调控作用。