尼罗罗非鱼Hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌活性

Hepcidin是一类分子量较小、富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,TH1-5则是从莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中分离到的3种hepcidin cDNA序列中的1种;虽然化学合成的TH1-5的成熟肽显示了对若干细菌的抑菌活性,但通过重组DNA表达的此肽是否也具生物学活性则是未知的。本文参考莫桑比克罗非鱼hepcidin TH1-5的核苷酸序列,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肝脏为基因克隆的材料,对其类似于hepcidin TH1-5的成熟肽(mTH)进行了重组DNA表达。在构建的重组表达质粒"pET-32a-mTH"中,mTH基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的trxA基因融合,25℃下,经1mmol/L IPTG诱导培养8h后,在E.coli BL21(DE3)中成功表达了"trxA-mTH"融合蛋白。经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后的融合蛋白并不显示抑菌活性,但经肠激酶消化处理后,释放出的重组mTH显示了对革兰氏阳性的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。     

抗菌肽Folicidin-3在大肠杆菌中融合表达及抑菌活性

根据抗菌肽Fowlicidin-3氨基酸序列,选用大肠杆菌(Escherichia coli)偏嗜密码子,设计合成117 bp的Fowlicidin-3a和102 bp的Fowlicidin-3b基因.将这2个基因克隆到突变载体,构建出表达载体pET-32 a-C-Fowlicidin-3a和pET-32a-Tev-C...     

乳糖诱导家蚕抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

根据家蚕抗菌肽Cecropin B的氨基酸序列,按大肠杆菌基因偏爱密码子,人工合成改造过的Cecropin B基因。将改造过的Cecropin B基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-41a中,构建了融合蛋白表达载体pET41a-cecB,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达Cecropin B的大肠杆菌工程菌株。通过SDS-PAGE分析,研究了用乳糖代替IPTG诱导大肠杆菌BL21表达家蚕抗菌肽Cecropin B的诱导条件,得到乳糖的最佳用量为0.25 mmol/L、诱导起始浓度为OD 1.0、诱导时间为5 h。最终Cecropin B的表达量可占细胞总蛋白的17.1%。为乳糖作为诱导剂应用于大肠杆菌生产重组家蚕抗菌肽提供了参考依据。     

乌骨鸡Cathelicidins 类抗菌肽基因在大肠杆菌中的融合表达与抑菌活性

Cathelicidins抗菌肽是含高度保守cathelin结构域的一大类抗菌肽,在家禽天然免疫系统中发挥重要作用。通过PCR方法,从含乌骨鸡Cathelicidins抗菌肽基因（CathL\|1,\|2,\|3）cDNA完整序列的质粒pMD\|CathL中分别扩增Cathelicidins\|1,\|2,\|3成熟肽的编码序列,将其分别克隆至原核表达载体pET\|30a（+）中,构建其重组表达质粒pET30\|CathL1S,pET30\|CathL2S,pET30\|CathL3S,经测序验证的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株。阳性克隆菌株在37℃,10 mmol·L-1 IPTG的条件下进行诱导表达。SDS\|PAGE和Western\|blot分析表明,Cathelicidins成熟肽片段均在大肠杆菌中以融合形式成功表达,表达产物的表观分子量分别为70,80,75 kD。琼脂糖孔穴扩散法检测显示表达产物对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、鸡白痢沙门氏菌C79\|13 （Salmonella pullorum）、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、绿脓杆菌等供试菌株均有较强的抑制作用,尤其对抗生素耐药菌株有明显的抑制作用。     

抗菌肽CMIV在大肠杆菌中的表达与纯化

用PCR定点突变技术将改造的家蚕抗菌肽CMIV引入6×His·Tag序列,构建大肠杆菌硫氧还蛋白融合型表达载体pTrxFus-CMIV,转化GI724得到阳行Ni2 预装柱进行"一步纯化法"分离及纯化,得到了重组的抗菌肽.纯化产物与经过非变性凝胶电泳目的带的电洗脱、脱盐、肠激酶切割后、初步抑菌实验的结果一致.试验结果为以后的研究和生产奠定了基础.     

鲎抗菌肽polyphemusinⅡ基因的改造、克隆及其在大肠杆菌中的表达

中国鲎(Tachypleus trideutatus)血细胞产生的抗菌肽(Antibacterial peptide)—鲎素,具有广谱的杀菌、抑病毒和抗肿瘤细胞的作用。实验根据已报道的美洲鲎的抗菌肽polyphemusinⅡ氨基酸序列,设计了一对引物,并对原抗菌肽基因进行改造,在基因开放阅读框末端添加了Asn密码子,使抗菌肽羧基末端酰胺化,旨在提高其稳定性和抗菌活性。PCR扩增获得改造过的目的片段,连接于载体pMD18-T,测序后,与pEI-28c(+)连接,构建表达质粒pET28c-rr,测序鉴定正确后,转化大肠杆菌E.coli.BK21(DE3)。表达菌株经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导后以包涵体的形式表达,在体外表现出明显的抑菌活性。     

斑点叉尾鮰hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

通过RT-PCR从斑点叉尾鮰肝脏中克隆编码hepcidin原前体肽的基因"pIH"。与参考序列相比,显示两个氨基酸残基的变异。通过对编码hepcidin原前体肽的基因添加EcoR I和HindⅢ酶切位点,选择含"trxA"融合头的pET32a(+)作为表达质粒、E.coliBL21(DE3)作为工程菌,成功构建"pET32a-pIH"原核表达系统。阳性克隆经1 mmol.L-1IPTG诱导、在37℃培养12 h后,表达的"trxA-pIH"融合蛋白70%以上可溶。Tricine-SDS-PAGE分析表明,细胞经超声破碎后的上清通过固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后,可获得高纯度的目的蛋白。     

新型抗菌蛋白内溶素在大肠杆菌中的融合表达与纯化

抗菌蛋白E17G是一种通过基因改造获得的高效杀菌蛋白。为高效表达抗菌蛋白E17G并减少E17G的抗菌活性对大肠杆菌宿主菌的致死作用,将E17G基因克隆到原核表达载体pGEX 6P 1中,构建的重组原核表达载体pGEX 6P 1 E17G在低温下经IPTG诱导,E17G蛋白在大肠杆菌BL21中以GST E17G融合蛋白的形式表达,采用GST亲和层析纯化和收集GST E17G融合蛋白。SDS PAGE和Western blotting检测结果显示,GST E17G能在大肠杆菌中正确表达,为进一步研究E17G抗菌蛋白的生物学活性奠定了基础。     

萝卜抗菌肽基因AFP的克隆及其在大肠杆菌中的诱导表达

试验采用RT-PCR方法,从萝卜叶子中克隆得到抗菌肽基因AFP(antifungal protein)。该基因全长240个碱基,79个氨基酸。经测序证明克隆所得基因与GeneBank中发表的原序列一致。将此抗菌肽基因克隆到E. coli表达载体pET28a,在IPTG的诱导下表达出含有AFP的11.99 ODD,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达。     

抗菌肽MagaininⅡ基因的克隆及其在E.coil BLP中的融合表达

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽MagaininⅡ基因,定向克隆至表达载体pET28a,将构建的重组质粒pET28a-Mag转化至E．coli BLP,Amp抗性筛选的阳性克隆用IFFG诱导融合表达。利用Tricine-SDS-PAGE确定了产物的正确性,利用琼脂孔穴扩散法证明表达产物具有抗菌活性。     

Advances in Antimicrobial Peptides and Expression Strategy

Antimicrobial peptides are widely distributed in nature,existing in organisms of plants,insects,and vertebrates.It has been approved that antimicrobial peptides have broad spectrum antimicrobial activities,and play a key modulatory role in the innate immune response and tumor inhibiting activity.Due to the special action mechanism,the antimicrobial peptides become a hot field of genetic engineering.In the present paper,the general properties,mechanism of action,application value,existing problems,the latest...     

中华蜜蜂Apidaecin的重组表达及其抗菌活性

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠肠道细胞因子（促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10）的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183 bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（内含高度保守的8个氨基酸序列）,编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L ^-1,诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中纯化得到约20 mg抗菌肽。药敏试验显示,重组抗菌肽Apidaecin在体外与阴性对照相比有明显抑菌圈出现,且测得的最小抑菌浓度为10 mg·L ^-1;在小鼠体内,腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin的染菌试验组与注射生理盐水的染菌试验组相比免疫球蛋白含量差异显著(P<0.05),说明腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin能够有效缓解由大肠杆菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加;同时,小鼠肠道相关蛋白的基因表达量也差异显著(P<0.05),说明重组抗菌肽Apidaecin能够有效保护被大肠杆菌K88侵染的小鼠肠道。【结论】在枯草芽孢杆菌中能够成功重组表达中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,并且纯化后的中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin在体外对大肠杆菌K88有良好的抗菌效果;经腹腔注射进入小鼠体内,能够提高小鼠的免疫机能,有效抵抗大肠杆菌K88对小鼠的侵染。     

植酸对大肠杆菌抑菌机理的研究

为了研究植酸对大肠杆菌的抑菌机理,测定了植酸对大肠杆菌的抑菌效果、最小抑菌浓度、细菌生长曲线、菌液碱性磷酸酶(AKP)含量及电导率,并观察了细菌超微结构。结果表明,植酸对大肠杆菌有较强的抑菌效果,且随着浓度的增大而增强,植酸对大肠杆菌的最低抑菌浓度(体积分数)为0.4%;与不添加植酸的对照相比,植酸改变了大肠杆菌的生长规律,使细胞破损严重,细胞壁和细胞膜通透性增加,细胞质外渗,菌液中AKP含量和电导率增大。     

广西猪源致病性大肠杆菌对抗菌药物 的耐药性变化分析

[目的]分析2007和2016年广西猪源致病性大肠杆菌对抗菌药物的耐药性差异,为兽医临床用药防治猪大肠杆菌病提供参考依据.[方法]2016年初从广西25个猪场采集腹泻仔猪的肠内容物、直肠棉拭子或肠系膜淋巴结等200份样品,分离大肠杆菌后进行致病力试验,选取103株致病性大肠杆菌用于体外药敏试验,将药敏试验结果与2007年的相关结果进行对比分析.[结果]从腹泻仔猪的体内共分离获得大肠杆菌178株,分离率为89%,其中有143株大肠杆菌可致试验小鼠死亡.与2007年相比,2016年广西猪源致病性大肠杆菌对50%的抗菌药物(9种)的敏感率上升,50%的抗菌药物的敏感率下降,上升最明显的为壮观霉素,升高34.9%,下降最明显的为氟苯尼考,降低46.9%;除头孢曲松和强力霉素的中介率与2007年相比基本无变化外,其余16种抗菌药物的中介率均降低,最明显的为头孢拉啶,降低55.2%;耐药率降低的抗菌药物只有阿米卡星、壮观霉素和强力霉素3种,降低12.3%~15.5%,耐药率升高的抗菌药物有15种,上升率为1.2%~62.1%,其中阿莫西林上升62.1%,氟苯尼考上升57.0%.耐药谱方面,2007年以5~11重耐药为主,占受试菌总数的75.7%,2016年以11重耐药以上为主,占74.8%.[结论]当前广西猪源致病性大肠杆菌以广谱耐药为主,敏感性降低,中介率降低,耐药率明显升高,生产中可选用阿米卡星和壮观霉素进行猪大肠杆菌病防治.     

抗菌肽作为饲料添加剂的应用展望

传统抗生素作为饲料添加剂在饲料业中面临着被淘汰的局面.抗菌肽是一类小分子多肽,具有抗菌、抗病毒等多种功能,同时,还具有热稳定性强的特点,有望成为一类很好的抗生素饲料添加剂替代品.     

海洋动物抗菌肽的研究进展

随着人们对食品安全的要求越来越高,抗菌肽因相对于抗生素而言具有不产生抗药性的主要特点而越来越引起人们的关注.本文论述了海洋动物抗菌肽的研究进展、作用机理以及对其在水产养殖中应用前景.     

木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中的表达研究

通过引物拼接的方式合成采用大肠杆菌优势密码子的疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶基因xynA,插入到热激质粒pHsh和质粒pET-20b中构建重组质粒pHsh-xynA和pET-20b-xynA,再转入大肠杆菌JM109表达。经热激和IPTG诱导后,木聚糖酶在重组菌中获得特异性表达,产物以胞内可溶性蛋白和包涵体形式存在。重组菌pET-20b-xynA在16℃下表达量最大,胞内酶活达42.13 U/ml,重组菌pHsh-xynA在42℃下胞内酶活最大,为35.06 U/ml。与质粒pHsh相比,pET-20b质粒更有利于重组木聚糖酶的表达。     

thanatin 串联抗菌肽原核表达研究

抗菌肽thanatin是一类广谱性的阳离子抗菌活性肽,对病原性真菌有很好的杀灭效果。为了提高thanatin抗菌肽表达丰度,将3个thanatin单体拷贝基因进行串联,与MBP蛋白进行融合表达,表达的产物经过酶切纯化后,通过Western blot和质谱鉴定,结果表明3×thanatin在大肠埃希菌中成功表达,对核盘菌的抑菌活性测定结果表明,原核表达的3×thanatin最低抑菌浓度为6.6 μmol·L^-1, 而化学合成的thanatin抗菌肽对核盘菌的抑菌浓度约为64 μmol·L^-1,3×thanatin抗菌肽对核盘菌的抑菌活性提升了约1个数量级。     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...