利用gus基因瞬时表达探讨菊花叶盘基因枪转化参数

为了将基因枪转化方法应用于菊花的遗传改良和品种选育,以gus基因为报告基因,利用基因枪方法将其转入菊花外植体内,通过检测gus基因在菊花叶盘中的瞬时表达情况,分析了轰击距离、氦气压力、金粉用量、质粒DNA浓度、轰击后培养时间、轰击次数等参数对gus瞬时表达的影响。结果表明,以幼嫩叶片为受体材料,在射程为6 cm、氦气压力为7.584×106Pa,每枪金粉用量为400μg,质粒DNA用量为3μg,轰击2次的条件下,2 d后可检测gus基因的最佳表达活性和最高瞬时表达率。     

番茄叶片液泡转化酶基因植物反义表达载体的构建与瞬时表达

在分析植物液泡转化酶基因保守区序列的基础上,设计1对PCR引物,以番茄(中蔬四号)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为668 bp的cDNA片段,并克隆入pMD-18 T simple载体。测序结果表明,所获得的片段为番茄液泡转化酶基因TIV1的片段;PCR和酶切分析表明,该片段已成功定向连入到双无载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建成反义植物表达载体pBinAR-aTIV1;菌落PCR表明质粒成功转化入农杆菌EHA105;瞬时表达证明该反义片段对番茄叶片液泡转化酶活性具有明显的抑制效果。     

GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能

本试验以pAyGUS为转化质粒,该质粒为小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ay的启动子和β-葡糖苷酸酶(GUS)基因的重组质粒,利用基因枪法将该质粒导入小麦胚乳及胚中,检测其表达活性。通过X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦种子中特异表达,可见小麦1Ay基因的启动子具有在小麦胚乳中特异表达的活性,这为小麦品种改良及转基因研究奠定了基础。     

基因枪法介导的南瓜的遗传转化体系构建

用南瓜的愈伤组织作受体进行了基因枪的轰击试验,确立了以轰击压力为1 100 psi,轰击距离为9 cm,3μLDNA／mg金粉的轰击比例,优化了基因枪的轰击参数;在轰击前4 h和轰击后16 h用附加有0．4 mol／L甘露醇的MS培养基进行高渗处理、轰击后恢复培养6 d,可以增加转化成功的机率。用1 mg／LBasta作 为选择压,筛选培养45 d后进行GUS基因组织化学染色,结果表明GUS基因可在南瓜的组织中瞬时表达。     

甘蓝型油菜SNARE蛋白SYP122叶片瞬时表达体系的建立

通过生物信息学鉴定了油菜中的突触融合蛋白BnSYP122,其由一个N端syntaxin结构域、一个典型的SNARE基序及一个C端跨膜结构域组成,并且N端结构域包含被称为Ha、Hb、Hc基序的3个α-螺旋束.进一步利用Gateway技术成功将目的蛋白构建于植物表达载体pEarleyGate 104上,与带有绿色荧光蛋白的pEGAD分别转化农杆菌GV3101菌株,采用农杆菌介导的真空渗透法在油菜叶片中进行瞬时表达.经激光共聚焦显微镜观察和Western blot检测表明,农杆菌介导的真空渗透法能够在油菜叶片中成功表达目的蛋白,同时验证了BnSYP122定位在细胞膜上.     

利用GUS瞬时表达探讨香石竹品种“云红二号”基因枪转化参数

利用基因枪法和带有GUS基因的双元表达载体pBI121转化香石竹品种"云红二号"的外植体。通过检测GUS基因在香石竹叶片和茎段上的瞬时表达情况,分析受体材料、轰击距离及氦气压力对GUS瞬时表达的影响。结果表明,以茎段为受体材料,在射程为6 cm、氦气压力为1100 psi下,可检测到GUS基因较好的表达活性,瞬时表达率最高可达8.33%。     

SARS-CoVS基因重组质粒的构建与瞬时表达

根据GenBank中登录的SARS-COV（BJ01株）基因序列设计引物，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从SARS病毒中扩增得到约3768bp的片段，将其克隆到真核表达质粒pVAX1，鉴定正确后．命名为pVAX1／S。体外转染Hela细胞．间接免疫荧光鉴定S蛋白的表达。构建的重组质粒经酶切及测序鉴定．开放阅读框正确；间接免疫荧光方法鉴定该重组质粒能在Hela细胞中表达。     

基因枪转化小麦愈伤组织的影响因素研究

以小麦愈伤组织为受体材料,用基因枪法将报告基因GUS和目的基因Psag12-IPT导入小麦中。GUS基因表达检测表明,金粉用量越高,转化频率越高;质粒DNA用量以2.0μg/枪最佳;随着愈伤组织培养时间的延长,GUS基因瞬时表达呈明显下降趋势,至第28天以后趋于稳定。另外,GUS基因瞬时表达检测应在24h内进行。     

伪狂犬病毒基因转移载体的快速构建及其瞬时表达

以含有伪狂犬病毒（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｕｓ,ＰＲＶ）蛋白激酶（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ,ＰＫ）基因的重组质粒为基础,利用非互补粘性经过部分补平后成为粘性末端,再进行连接的方法克隆了与载体分子大小相当的报告基因表达盒。用限制发现人切酶分析确证了伪狂现毒表达载体中报宽大圊窝囊斩主方向,并通过导入细胞后检测外源基因在体外的瞬时表达,直接鉴定一表达载体的生物学活性。     

小麦成熟胚再生体系及基因枪转化的初步研究

以小麦品种晋麦2148的成熟胚为外植体,消毒后用解剖刀刨碎,接种于MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+2mg·L-12,4D+8g·L-1琼脂糖的培养基中诱导愈伤组织,将诱导3周的成熟胚愈伤组织接种到胚状体成熟培养基(MS+VB5+11.2g·L-1葡萄糖+0.2mg·L-1IAA+8g·L-1琼脂糖)中培养4-8周,然后转接到再生培养基(1/2MS+VB5+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂糖)中进行再生成苗.接种1200块成熟胚,得到1123块愈伤组织,最终形成258株再生苗,再生率为21.5%.在建立了再生体系的基础上,用基因枪介导法将GUS基因导入成熟胚愈伤组织,Xgluc染色表明,GUS基因已经在小麦成熟胚愈伤组织中表达.将100块愈伤组织用Xgluc染色,29块愈伤组织出现肉眼可见的蓝色小点.     

A Transient Expression System for the Functional Assessment of Early Response Genes on the Powdery Mildew Infected Barley or Wheat Leaves

The principle and the basic steps of the transient assay system for the functional assessment ofearly response genes on the powdery mildew infected barley or wheat leaves were summarized in brief. The development of this technology and its extensive application were reviewed. Future studies on this approach wererecommended in this paper.     

小麦基因枪高效转化体系的建立

以小麦幼胚为基因枪转化受体 ,用含GUS和bar基因的质粒pDM80 3对小麦幼胚进行转化 ,并对幼胚大小、轰击距离、质粒和金粉用量等参数对GUS瞬时表达率及表达量的影响进行了研究。幼胚以 1 0～ 1 5mm最为适宜 ,6cm和 9cm各轰击一次、质粒 0 .5μg/枪及金粉 30 0 μg/枪 ,GUS瞬时表达率及表达量最高。通过对以上参数的优化 ,建立了一个高效的小麦基因枪转化体系。     

灌浆期高温对小麦旗叶中SOD和GR活性及相关基因表达量的影响

以山农23和济麦20为试验材料,研究灌浆期(花后10~20 d)高温对小麦旗叶中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性及相关基因表达量的影响。结果表明,在高温胁迫条件下,山农23的SOD活性一直显著高于对照,而济麦20的SOD活性变化呈先升高后降低的趋势。山农23中Fe-SOD和Mn-SOD表达量的变化与SOD活性的变化趋势相似,但Cu/Zn-SOD表达量的变化与SOD活性的变化趋势不同。济麦20中3个SOD基因表达量的变化均与SOD活性的变化基本一致。高温胁迫条件下两个小麦品种的GR活性均呈现先升高后降低的趋势,山农23中GR表达量的变化与GR活性的变化趋势基本一致,济麦20中GR表达量的变化早于GR活性的变化。总体来看,高温胁迫条件下山农23具有较强的抗氧化能力,Fe-SOD和Mn-SOD基因对SOD活性起主要作用,抗氧化酶相关基因对灌浆期高温胁迫的响应比酶活性更敏感。     

铁胁迫小麦根DDRT-PCR分析及ABC基因的表达差异

 采用ＤＤＲＴ－ＰＣＲ技术比较了正常供铁和缺铁胁迫下铁高效型小麦（京－４１１）和铁低效型小麦（三属麦－３）的基因表达差异模式。利用从ＤＤＲＴ－ＰＣＲ中挑选出的ＡＢＣ的ｃＤＮＡ片段为探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，证明它的基因表达受缺铁胁迫的抑制     

四环素阻遏-蛋白与热激因子融合转录激活子的构建

为构建一新型低毒且受四环素负调控的基因表达调控系统,克隆了大肠杆菌XL1-BLUE四环素阻遏蛋白基因TetR和拟南芥热激因子基因Athsf1a缺失片段AtHSFC157,将两基因融合获得TetR:AtHSFC157融合片段作为四环素调控系统转录激活子,将其克隆入表达载体pXNSC2020中,成功构建了四环素负调控系统p35SC157-Om35Sgus。采用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105中,并通过农杆菌介导烟草叶片瞬间表达,以组织化学法检测GUS基因表达活性;结果在不加四环素处理条件下组织化学法检测到很强的GUS活性,而在含有1mg/L四环素的培养基中培养却没有检测到GUS活性;结论表明该技术所构建的新型四环素调控系统具有典型的受四环素负调控功能。     

农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化

以烟草叶片为试材,用转入植物表达载体pBI121的根癌农杆菌EHA105进行遗传转化。通过分析菌液不同浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度及共培养时间对GUS基因表达的影响,研究其瞬时表达的最佳条件。结果显示:用OD600值为0.6的农杆菌侵染6min,在培养基中添加120μmol.L-1的乙酰丁香酮,共培养2d,能够得到高效的GUS基因瞬时表达。     

Differential Gene Expression Between Cross-Fertilized and Self-Fertilized Kernels During the Early Stages of Seed Development in Wheat

In order to understand molecular basis of cross-fertilized kernel advantage and heterosis, improved differential display of mRNA was used in this study to analyze alterations in gene expression between cross-fertilized and self-fertilized kernels at 2, 4, 6, 8, 10 and 12 days after pollination (DAP) by using 3 wheat hybrids with different level of heterosis. Four patterns of differential expression were observed: (i) bands observed in cross-fertilized kernels but not in self-fertilized kernels (BCnS); (ii) bands occurring in only self-fertilized kernels but not in cross-fertilized kernels (BSnC); (iii) cDNA over-expressed in cross-fertilized kernels compared to self-fertilized kernels (OEC);(iv) cDNA under-expressed in cross-fertilized kernels compared to self-fertilized kernels (UEC). Further analysis showed that BCnS is positively correlated with heterosis, but BSnC is negatively correlated with heterosis. Four differentially expressed cDNA fragments were verified by reverse-northern blot and sequence homology search in GenBank showed that one of them was new sequences; the other exhibited higher similarity to NBS-LRR type resistance protein, 1;6-bisphosphatase and photosystem Ⅱ chlorophyll a-binding protein psbB, respectively, which indicated diverse pathways may be involved in heterosis formation.