白斑综合征病毒感染梭子蟹试验及组织病理学观察

利用对虾白斑综合征病毒WSSV,采用注射和投喂方式,对养殖三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）进行人工感染,以确定WSSV对养殖梭子蟹的易感性和可能存在的潜在危害。结果发现,在水温24—25℃条件下,病毒注射感染组全部发病,10-16d全部死亡;投喂组死亡率33％;对照组未出现死亡。采用荧光定量PCR对各试验组梭子蟹的肌肉和肝胰腺混合物进行WSSV检测,发现注射感染组阳性检出率为100％,均为强阳性;投喂组阳性检出率为50％;对照组的阳性检出率均为O。光镜下可观察到感染梭子蟹的肝胰腺、肌肉组织、鳃组织的靶细胞核肿大、变形,并出现以坏死为主的变质性病变;电镜下病变组织细胞中可见形态、大小与WSSV一致的病毒粒子。由此表明：对虾WSSV可以感染三疣梭子蟹,并表现出明显的病理症状,感染与病毒的数量以及梭子蟹自身的体质、环境条件密切相关。     

白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫多重PCR检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒（WSSV）和血卵涡鞕虫在GenBank中已发表的基因序列分别设计2对引物,建立了一种同时检测WSSV和血卵涡鞕虫的多重PCR方法,即通过一次PCR反应,同时扩增WSSV和血卵涡鞕虫2种病原的核酸。应用该方法分别对已知WSSV和血卵涡鞕虫阳性的样品进行PCR扩增,分别扩增出了2条特异性带———467 bp（WSSV）和168 bp（血卵涡鞕虫）,与实验设计相符,且与常规PCR检测结果一致。特异性实验结果也表明,该方法对WSSV和血卵涡鞕虫的检测均具很好的特异性,而对三疣梭子蟹其它常见病原、梭子蟹DNA样本的PCR扩增结果均为阴性。10份临床样品检测结果表明该检测结果与常规PCR检测结果符合率达到100%,说明所建立的多重PCR方法可以用于三疣梭子蟹2种病原的快速检测和鉴别诊断,对养殖三疣梭子蟹的疾病及时防控具有重要意义。     

三疣梭子蟹呼吸器管的组织学研究

三疣梭子蟹（Ｐｏｒｔｕｎｕｓｔｒｉｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ）的呼吸器官主要是鳃,两侧对称排列,每侧八枚,除第二枚关节鳃的鳃轴在一侧外,其余几枚的组织结构均相似,最外层为薄层角质膜,其深层为单层上皮。从鳃的横切面观察,背面血管为入鳃血管,腹面的为出鳃血管,连接这两条血管的结缔组织为鳃轴。鳃轴向两侧（或一侧）生出数条鳃丝。鳃丝主要由在细胞和上皮细胞构成,扫描电镜观察发现,入鳃血管的侧壁上有成列的卵圆形孔,这些孔与鳃丝相通。采用汞溴酚蓝等４种方法,对上述几种结构分别进行了组织化学研究。     

PCR检测对虾白斑综合征病毒的组织特异性

该研究提取了95%酒精保存的病虾组织(鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼)的基因组总DNA,并进行了对虾白斑综合征病毒的PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示,病虾组织(鳃、肌肉、表皮、附肢和复眼)有轻微的跑带现象,鳃和肌肉比表皮、附肢和复眼的基因组总DNA电泳条带亮。PCR检测结果发现,对虾不同组织的阳性检出率高低顺序如下:鳃肌肉=表皮附肢复眼。研究结果说明,鳃和肌肉可作为对虾白斑综合征病毒PCR检测的合适部位。     

三疣梭子蟹C-型凝集素CTL5基因的克隆及在病原刺激下的免疫应答

为明确三疣梭子蟹Portunus trituberculatus C-型凝集素CTL5的结构和功能,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end,RACE)技术克隆获得三疣梭子蟹C-型凝集素CTL5基因(PtCTL5)的cDNA全长。结果表明:PtCTL5基因全长为1026 bp,包含732 bp的开放阅读框,编码了243个氨基酸组成的蛋白,相对分子质量为26 000,为半乳糖结合型凝集素;Blast分析显示,PtCTL5氨基酸序列与克氏原螯虾Procambarus clarkia CTL的一致性最高,为41.84%;系统进化树分析显示,PtCTL5与已发表的三疣梭子蟹的另4种C-型凝集素亲缘关系较远;胚胎及幼体不同发育时期的定量分析表明,PtCTL5在溞状幼体Ⅲ期表达量最高,在胚胎发育的心跳期表达量最低;组织表达分析显示,PtCTL5在血细胞中的表达量最高,肝胰腺中次之;人工注射副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus后,PtCTL5在血细胞和肝胰腺中的表达量均于72 h时达到峰值;而注射对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后,PtCTL5在血细胞和肝胰腺中的表达量分别于72、12 h达到峰值且显著高于对照组(P<0.05)。研究表明,C-型凝集素在三疣梭子蟹先天免疫中具有一定的功能,本研究结果可为进一步解析三疣梭子蟹免疫应答机制提供参考。     

天津地区三疣梭子蟹人工育苗高产的关键技术

三疣梭子蟹(Portuns tirtuberculatus Miers)隶属节肢动物门,甲壳纲,十足目,爬行亚目,短尾族,游泳蟹科,梭子蟹属.广泛分布于我国水深10～30 m的沙泥或沙质海底.三疣梭子蟹是我国近海名贵海产品之一,个体硕大,最大个体可达1000g,一般可达400 g,肉质鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱.近年来,由于过度捕捞及海水污染等原因,三疣梭子蟹资源量锐减,远不能满足市场需求.随着养殖规模的持续扩大和国家增殖放流的数量增加,对苗种的需求量不断增大.文章针对海捕三疣梭子蟹育苗生产实践,探讨苗种高产的关键技术.几年来,累计培育Ⅱ期仔蟹1 278 kg.平均出苗0.44 kg/m3,最高出苗0.78 kg/m3.抱卵蟹最高出苗10.2 kg/只.     

IBV陕西分离株人工感染雏鸡的临床病理学研究

用ＩＢＶ陕西分离株Ｘ，Ｆｕ，Ｗ和Ｈ株人工感染４０日龄和１９日龄的雏鸡复制人工病例，对其临床症状、大体病变和病理组织学变化进行了较详细的研究。结果表明，ＩＢＶ陕西分离株具有较强的致病力，不仅能引起雏鸡发生呼吸道症状，而且可致严重的肾脏损伤，对１９日龄鸡引起的临床症状和病理损害均比４０日龄鸡更为严重。感染４０日龄和１９日龄鸡后，潜伏期、致死雏鸡的时间与病程分别为３８￣７２ｈ和３２￣４０ｈ，９６ｈ和４８     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104¹05。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子.用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46% ～52% 蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%～46%蔗糖梯度之间;在57%～62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌.实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带嚢膜的病毒颗粒.     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104~105。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

三疣梭子蟹池塘笼式吊养技术研究

为解决三疣梭子蟹传统养殖方式中的同类相残、雌雄争偶以及集中上市而价格低迷等问题,2002年,分别在河蟹幼蟹培育池、虾池进行了三疣梭子蟹竹笼吊养及散养对照试验。2003—2004年,利用河蟹幼蟹培育池进行了三疣梭子蟹的笼式吊养生产,养殖面积13.34hm2,收获0.300kg/只以上商品蟹分别为104720.0kg和118625.0kg,商品蟹平均产量分别为7850.1kg/hm2和8892.4kg/hm2,产值分别为628006.00元/hm2和711394.30元/hm2,利润分别为368227.80元/hm2和407940.50元/hm2,年养殖平均成活率分别为68%和73%,2004年产量、利润及成活率分别较2002年虾池散养对照试验提高了70%、87%和52%,增收189867.00元/hm2。该项技术利用空闲的河蟹幼蟹培育池,采用笼式吊养全雌梭子蟹,方式新颖,效果明显,技术水平国内先进。     

三疣梭子蟹血清凝集素的生物学特性

对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血清凝集素的凝集特性进行了研究.结果表明:三疣梭子蟹血清凝集素对鲫鱼、中华鳖、草鱼、鸡和人类A、B、0型血细胞没有凝集作用,但是对小鼠、兔的血细胞表现出较强的凝集活性,其中对小鼠血细胞的血凝活性达到210,对兔血细胞的血凝活性达到28;盐度对其凝集活性有较大影响,NaCl浓度在0.6 mol/L以上时基本失活;凝集素活性最适pH值为6.0～7.4;血清凝集素对Ca2+、Mg2+离子有明显的依赖性,EDTA可以明显抑制其凝集活性;糖抑制结果表明,血清凝集素活性能被N-乙酰葡萄糖胺及N-乙酰甘露糖胺特异性抑制;对血清凝集素进行硫酸铵分级沉淀分离后,发现凝集素活性主要分布在25％饱和度硫酸铵沉淀区;聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,主要蛋白条带在72～95 ku.     

壳寡糖对三疣梭子蟹免疫力的影响

为研究壳寡糖对三疣梭子蟹免疫功能的影响,设置了含壳寡糖0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/kg（分别为T0、T1、T2、T3和T4组）的5组试验饲料饲喂三疣梭子蟹,分别在第10 d、20 d和30 d取血清进行酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LSZ）和过氧化物酶（POD）活性的测定,试验结束时测定血细胞的密度。结果显示,在基础饲料中添加适量的壳寡糖可以显著性提高ACP、T-SOD、LSZ、POD活力（P〈0.05）,对PO和AKP活力促进效果不显著（P〉0.05）。壳寡糖可以显著提高三疣梭子蟹血细胞密度（P〈0.05）,对3种血细胞所占比例有一定的影响（P〉0.05）。综合考虑,T2、T3组对三疣梭子蟹免疫促进效果较好,建议基础饲料中壳寡糖添加量为1.0～1.5 g/kg。     

三疣梭子蟹微卫星标记的筛选及特征分析

微卫星序列包含有多种重复单元,在其两碱基重复的类型当中,CT／GA重复类型在功能基因组中比例较高。三疣梭子蟹是重要的养殖品种,对遗传种质的分析需要开发大量的分子标记,本文利用5’锚定引物PCT筛选三疣梭子蟹的CT／AG微卫星分子标记,测序的41个克隆子中,35条序列含有微卫星DNA序列,阳性克隆比率达到85．4％,共检测到55个微卫星位点,分布于20条序列中,其中19条序列检测到2个或2个以上微卫星位点。对所有筛选到的微卫星位点进行分类统计后表明,核心序列为（CT／AG）的有27个（50％1,27个位点为其他类型的重复。结果表明三疣梭子蟹CT／AG微卫星标记在三疣梭子蟹基因组中含量较丰富,5’锚定引物法在筛选特定标记的同时,还筛选了其他类型的微卫星标记,具有较强的筛选效率。     

不同地理群体三疣梭子蟹非特异性免疫功能的比较

测定了海州湾、辽东湾、舟山沿海和莱州湾4个野生群体三疣梭子蟹(Porttmus tritubercalatus)的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织中的抗氧化及其它与非特异性免疫相关的酶活指标,并对这些指标在不同群体间的差异进行了比较.结果发现:海州湾群体的三疣梭子蟹肝胰腺SOD酶活显著高于莱州湾群体(P<0.05).而与其它两个群体差异不显著;而血淋巴和肌肉组织SOD酶活各个群体间差异均不显著(P>0.05).海州湾群体血淋巴和肝胰腺组织GSH-px酶活显著高于莱州湾群体(P<0.05),而与其它群体差异不显著(P>0.05).不同地理群体三疣梭子蟹各体组织中MDA含量、LSZ和ALP酶活均没有显著性差异(P>0.05).笔者全面比较了4个地理群体三疣梭子蟹免疫相关酶活指标的差异,揭示了不同地理群体三疣梭子蟹免疫、抗病能力差异的内在因素.     

富硒海洋小球藻对三疣梭子蟹血清中部分免疫活性酶的影响

对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)分别饲以单纯配合饵料(对照组)和"配合饵料+富硒藻粉"的混料(试验组),研究其血清中部分免疫活性因子超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)活性的变化,并对试验结果进行统计学分析。结果表明,试验组三疣梭子蟹血清中的SOD活性逐渐上升,至72 h达到最高点,比对照组高44%;ACP活性24 h即呈大幅度上升趋势,24 h时比对照组高97%,上升趋势维持到48 h达最高点(是对照组的3.7倍),72 h仍为对照组的2.8倍;AKP活性5、24 h分别比对照组高39%、38%,48 h达最高(比对照组高80%);CAT活性24 h是对照组的4.3倍,48 h仍为对照组的2.1倍。试验证实,在投喂"配合饵料+富硒藻粉"的混料72 h内,三疣梭子蟹体内的免疫因子发生了明显的变化,血清中SOD、ACP、AKP、CAT活性在不同时间段均有诱导性升高,显著高于对照组水平,说明饲喂普通饵料添加一定量富硒藻粉能有效激活三疣梭子蟹的免疫活性。     

浙江近海三疣梭子蟹4个群体的控制区序列分析

以浙江近海三疣梭子蟹大螯肌肉的线粒体DNA作为模板,对4群体共67个个体的控制区（D-loop）序列进行了PCR扩增。通过对PCR产物进行双向测序,最终得到了控制区3’端的rRNA部分序列（64 bp）、D-loop全序列（1179 bp）及控制区5’端tRNA-Ile部分序列（73 bp）。经DNASP软件分析得知,67个D-loop序列定义了65个单倍型,在65个单倍型中,除去插入/缺失位点,所有单倍型共检测到344个多态位点,主要发生在D-loop序列的中间区域;D-loop序列检测到26个插入或缺失位点,碱基插入主要发生在中央后端区域,以13 bp重复片断插入的形式进行。每个个体含有0～3个连续重复片断。通过对三疣梭子蟹的遗传多样性分析发现,D-loop序列的单倍型多样性为0.982～1.000,核苷酸多样性指数为0.02770～0.03633,平均核苷酸差异数为31.790～43.304。综合分析,三个成蟹群体的遗传多样性相近,都低于仔蟹的遗传多样性,说明经过遗传育种,可以提高三疣梭子蟹的种质情况,真正实现对三疣梭子蟹的科学利用。     

三疣梭子蟹早期发育阶段最佳饵料投喂策略及投喂密度探讨

三疣梭子蟹是大型可食经济蟹类,具有很高的商业价值。为发展三疣梭子蟹育苗技术,试验对其早期发育阶段的饵料选择、投喂策略及最佳捕食密度进行了探讨。实验设置小球藻组、扁藻组、小球藻与扁藻混合组、轮虫组(加小球藻50×104个/ml)和卤虫组(加扁藻8×104个/ml)5个因素,分别设4、4、4、6和6个梯度。结果表明,小球藻浓度50×104个/ml或扁藻浓度8×104个/ml或小球藻(25~40×104个/ml)+扁藻(2.5~4×104个/ml)可使Ⅰ期溞状幼体(Z1)存活较长时间,但仅投喂单胞藻类不能使Z1正常变态;自Z1开始投喂轮虫可使幼体正常发育至Ⅲ期溞状幼体(Z3),以后幼体发育迟缓,出现Ⅲ期、Ⅳ期溞状幼体(Z4)和大眼幼体(M)同时存在的现象。Z1对轮虫的最佳捕食密度为5个/幼体、Ⅱ期溞状幼体(Z2)为10个/幼体,存活率可分别达到95.7%和94%;从Z3开始应该投喂卤虫无节幼体,捕食密度为10个/幼体,存活率达到最高值为84.5%。从Z4开始投喂卤虫成体,Z4、M和Ⅰ期幼蟹(C)的最佳捕食密度为10个/幼体,存活率分别为90%、85.7%和82.9%。因此,三疣梭子蟹Z1和Z2应该投喂轮虫,最佳捕食密度分别为5个/幼体和10个/幼体;Z3开始投喂卤虫无节幼体,最佳捕食密度为10个/幼体。Z4开始投喂卤虫成体,最佳捕食密度为10个/幼体。同时,育苗水体中添加一定量的单胞藻类。