M6型A群链球菌表面烯醇化酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶特性的研究

表面烯醇化酶(surface enolase,SEN)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(surface glyceraldehydes -3 - phosphate dehydro - genase,sGAPDH)都是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)没有踌膜结构的膜表面蛋白,它们可能在GAS感染中起到重要的作用.在本研究中,对SEN和sGAPDH在M6型GAS不同生长阶段(即在对数期和稳定期)的表达情况进行检测分析.取对数期(OD600 =0.5 -0.6)和稳定期(OD600 =1.5- 1.6)的GAS,分别测定SEN和sGAPDH活性.同时用变溶菌素(mutanolysin)提取这2个生长阶段细胞壁结合蛋白,用Western blot检测该提取物中的SEN和sGAPDH.结果表明在相同菌细胞浊度的条件下,SEN在M6型GAS对数期时的表达量及活性比其稳定期时的高45％左右.虽然sGAPDH的表达量较高但活性很低(＜0.07mM NADH/min),并且在这2个生长阶段没有明显的差异.     

重组A群链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶与脂蛋白(a)的相互作用

三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是A群链球菌(group A Streptococcus,GAS)表面的纤溶酶原(Plg)受体之一,其C末端的赖氨酸残基可以与Plg的赖氨酸结合位点(LBS)相结合.脂蛋白(a)[Lp(a)]中的载脂蛋白(a)[Apu(a)]与Plg有很高的同源性.因此本实验室提出了Lp(a)可能与GA...     

链球菌表面烯醇化酶及其变异体重组蛋白的表达纯化

目的:表达并纯化M6型GAS表面烯醇化酶以及其敲除C末端赖氨酸残基重组蛋白(rSEN和rSENΔ434-435)。方法:克隆了M6型GAS ATCC32175的SEN基因以及SENΔ434-435基因,与pASK-IBA37载体连接后,表达蛋白并用亲和层析色谱纯化重组蛋白;通过酶促反应实验测定了重组蛋白的生物活性。结果:2种基因克隆条件稳定,蛋白表达量大,且纯化方法可靠,纯化的重组蛋白具有较高的生物活性。结论:成功表达并纯化了rSEN和rSENΔ434-435蛋白。     

链球菌表面烯醇化酶重组蛋白多克隆抗体的制备

制备M6型GAS表面烯醇化酶抗体。皮下多点注射GAS表面烯醇化酶重组蛋白(rSEN)免疫家兔,采用亲和层析纯化免疫血清,通过SDS-PAGE、ELISA、Western-Blot等方法检测抗体的特异性,并初步用制备的抗体检测了M6血清型GAS表面烯醇化酶的表达。制备的抗体蛋白纯度较高,检测的特异性较强,用制备的抗体可以检测到活体菌表面的烯醇化酶。成功制备并纯化得到了GAS表面烯醇化酶多克隆抗体。     

盐穗木醛脱氢酶基因HcALDH7A1原核表达载体的构建及蛋白诱导表达与优化

[目的]为构建盐穗木盐响应基因HcALDH7A1的原核表达载体并进行外源基因的诱导表达和优化.[方法]以实验室已构建好的p mD18-T Simple-HcALDH7A1/DH5α(Pst Ⅰ,SacⅠ)重组载体中盐穗木醛脱氢酶基因(HcALDH7A1)为模板,设计带有酶切位点(EcoRⅠ,XhoⅠ)的引物通过PCR扩增亚克隆到p mD18-TSimple vector中,测序鉴定正确后,通过EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切,构建重组的原核表达载体pET28a-HcALDH7 A1.将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达,并对其表达体系进行优化.[结果]成功构建盐穗木醛脱氢酶基因HcALDH7A1的原核表达载体,诱导HcALDH7A1外源基因表达蛋白优化的最佳条件为IPTG终浓度为0.6 mmol/L,30℃诱导时间为4h.融合蛋白分子量大小为61 kD.[结论]成功在大肠杆菌体内诱导表达盐穗木醛脱氢酶HcALDH7A1基因,并明确目的蛋白的最佳表达条件.为后续在原核表达系统大肠杆菌细胞中探索盐穗木HcALDH7A1的生物和非生物胁迫的功能奠定了基础.     

3-磷酸甘油醛脱氢酶、β-肌动蛋白和18S rRNA作为相对定量的内标在牙鲆发育阶段的稳定性比较

定量确定基因表达水平的方法主要有实时定量PCR和相对定量检测。一般只有在需要确定基因的拷贝数时,才利用实时定量PCR检测。目前大部分的研究中还是选择相对定量的检测。相对定量检测有Northern blot和相对定量PCR两种检测方法,均需要采用内标来确定目标基因的相对表达量。     

Bacillus.sp.bs-1的内切葡聚糖酶在大肠杆菌中表达条件的优化及其活性分析

用两个不同的表达载体pET-30a-C和pET-28a-C进行了Bacillus.sp.bs-1的内切葡聚糖酶在大肠杆菌中的诱导表达,确定了最佳可溶性诱导表达条件。pET-30a-C表达的内切葡聚糖酶在25℃,用1mM的IPTG诱导3h就可以达到最佳可溶性表达量。pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶在25℃,用0.8mM的IPTG诱导5h能够达到最佳可溶性表达量。对表达的内切葡聚糖酶活性进行了测定,并确定了最适反应条件。用Ni-NTA树脂纯化了表达的内切葡聚糖酶蛋白,得到单一的目的蛋白,并测定了纯化后的内切葡聚糖酶的比活力。pET-30a-C表达的内切葡聚糖酶的粗酶液活性为1489U/ml,比活力为723U/mg,pET-28a-C表达的内切葡聚糖酶的粗酶液活性为683U/ml,比活力为808U/mg。此结果为枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶在工业应用方面提供了理论依据。     

无乳链球菌分选酶A的表达、纯化与活性检测

以提取的无乳链球菌ATCC51487菌株全基因组为模板,通过PCR扩增出srtA_(ΔN82)基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切、抗性筛选等方法构建重组表达载体,测定不同诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间对表达产物的影响,利用亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,并使用荧光共振能量转移法测定蛋白活性。结果显示,试验构建的pGEX-6p-1-srtA_(ΔN82)载体转化至BL21(DE3)后,在37℃条件下经1 mmol/L IPTG诱导表达6 h后可得到大量的可溶性蛋白,且纯度大于85%。纯化后的SrtA_(ΔN82)与底物作用后,可显著提高反应体系的荧光强度,表明得到的SrtA_(ΔN82)具有较好的生物学活性。     

A群链球菌脂磷壁酸的提取纯化及其抑瘤活性

为了研究A群链球菌制剂中的活性成分脂磷壁酸(LTA)的提纯方法和抗肿瘤活性,以A群链球菌为出发菌株,采用冷酚法提取A群链球菌制剂中的活性成分脂磷壁酸,经Sepharose CL-4B纯化,用红外图谱比较与脂磷壁酸标品(从金黄色葡萄球菌中提取得到)结构的类同,用气相色谱分析脂磷壁酸中脂肪酸和单糖结构组成,并研究脂磷壁酸的抑瘤活性.结果表明:纯化后的脂磷壁酸所含的蛋白质和核酸污染很低,脂磷壁酸的成分中有甘油磷酸基本骨架、脂肪酸和单糖结构;活性试验证明LTA对子宫癌细胞(Hela细胞)、腹水型EAC瘤和S_180肿瘤具有一定的抑制作用.     

苦荞蔗糖合酶SuSy基因在大肠杆菌中的表达及其纯化

【目的】探究苦荞蔗糖合酶结构与功能的关系,构建表达载体以实现SuSy基因在大肠杆菌中的表达,并经亲和层析纯化后得到重组SuSy蛋白,为进一步研究该酶的结构和功能奠定基础.【方法】以苦荞(Fagopyrum tataricum)cDNA文库中克隆得到的蔗糖合酶基因重组质粒为模板,PCR扩增得到SuSy编码序列,将其与原核生物表达载体pET28a相连接构建了重组表达载体pET28a-SuSy,经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切及测序鉴定正确后将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达SuSy重组蛋白,并对其诱导表达条件进行优化.【结果】在37℃、1.2 mmol/L IPTG诱导10 h时,SuSy蛋白表达量最高,分子量大小约为53.4 ku,超声破碎后经SDS-PAGE检测到该蛋白以包涵体形式存在.【结论】利用Co²⁺亲和柱层析纯化和His-tag鉴定得到了高纯度的重组SuSy蛋白,为该酶结构与功能的研究及多克隆抗体制备奠定了基础.     

人Troponin I的表达载体构建诱导表达和纯化及活性测定

以人肝脏cDNA文库为模板,通过PCR方法扩增出Tropon in基因,将其克隆到pCR-TOPO质粒中,构建表达质粒pET-22 b(+)-TnI,转化大肠杆菌BL 21(DE 3)-RPX并进行诱导表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20%以上并主要以可溶形式存在。建立了Tropon in I的非亲和色谱纯化工艺,纯化后蛋白产量约为20 mg/L,纯度在90%以上。体外活性实验表明重组蛋白具有良好的抗血管生成。