灰飞虱体内沃尔巴克氏体的检测

采用沃尔巴克氏体(Wolbachia)表面蛋白基因(wsp基因)的通用引物81F和691R对河北曲阳和容城灰飞虱(Laodelphax striatellus)体内的Wolbachia进行PCR检测,结果表明,从灰飞虱DNA样品中可扩增出600 bp大小的wsp目的基因片段,证实河北曲阳和容城田间的灰飞虱种群有Wolbachia 感染;对wsp目的基因片段的序列测定和同源性分析表明,河北的2个灰飞虱种群感染的Wolbachia与来自白背飞虱的wFur品系、灰飞虱的wStri品系亲缘关系较近,同属于Wolbachia B大组Con组.     

大豆尿黑酸叶绿基转移酶基因的克隆与进化分析

采用基于EST的电子克隆方法,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的尿黑酸叶绿基转移酶基因(Homogentisate phytyltransferase,HPT)cDNA序列为信息探针,对大豆的EST数据库进行同源检索筛选,获得了1 777 bp长大豆HPT基因的cDNA序列(GenBank登录号为:AY956421),经RT-PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,表明与电子克隆序列一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,173～1 408 bp),推测编码411个氨基酸的蛋白。该蛋白与拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、光合集胞蓝细菌(Synechocystis)的序列进行了比较,发现该基因具有保守性。     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

灰飞虱来源的水稻条纹病毒病害特异性蛋白基因遗传多样性

对来自江苏、云南、山东、河北等地灰飞虱来源的21个水稻条纹病毒分离物的病害特异性蛋白(sp)基因进行了遗传多样性分析研究。序列测定表明,所有分离物的sp基因大小相同,均由537个核苷酸组成,编码178个氨基酸和1个终止密码子。采用DNAStar软件进行分析,21个RSV分离物核苷酸和推导的编码蛋白氨基酸序列同源性分别为96.1%~100%和95.5%~100%。与已报道水稻来源的27个RSV分离物一起进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明,RSV-sp基因核苷酸序列变异相对较大,除灰飞虱来源的或者云南来源的分离物相对独立成组外无明显的规律性。从功能上分析,其遗传多样性首先与寄主相关,从寄主角度可以划分为灰飞虱和水稻两个寄主群;其次与地缘相关,在灰飞虱寄主群中可以分成中国云南及云南以外的两个地理亚群,在水稻寄主群中可以划分为中国云南和云南以外的多个地理亚群。     

割手密过氧化氢酶基因（Ss CA T-1）的克隆与比较分析

割手密是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有较强的抗逆性。本研究以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1) cDNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了2个割手密过氧化氢酶基因cDNA序列(Ss CA T-1c和Ss CA T-1d, GeneBank登录号为KF864229和KF864230)。2条序列全长均为1532 bp,包含10 bp的5'非翻译区(UTR)和43 bp的3'UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。2条序列之间相似性为99.2%,存在12个单核苷酸多态性(SNP)位点,蛋白相似性99.0%,存在5个氨基酸变异位点。将推测的SsCAT-1c和SsCAT-1d蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。研究结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材料CAT基因家族的信息提供帮助,从而为进一步通过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。     

脐橙CsCAB基因的克隆及表达载体构建

从脐橙果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,获得了一个CAB基因家族的同源EST序列,通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法成功克隆得到984bp的CsCAB全长基因(GenBank登录号EF010854)。序列分析结果表明,CsCAB包含一个621bp的开放阅读框(ORF),编码207个氨基酸;CsCAB蛋白与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand。并构建了脐橙CsCAB基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA1301-CABs和pCAMBIA1301-CABas,为该基因的功能研究奠定了基础。     

芝麻八氢番茄红素脱氢酶基因SiPDS的克隆与序列分析

来自芝麻的八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)的分离鉴定尚未见报道。本研究根据已报道植物PDS基因的氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码芝麻新蔡选抗PDS基因c DNA的中间片段。利用电子克隆技术,从芝麻EST数据库中比对得到一条高度同源的序列,并通过RT-PCR方法,从新蔡选抗成功克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因的c DNA,命名为Si PDS(Gen Bank登录号:KJ191121)。c DNA序列全长2 273 bp,开放阅读框长度为1 743 bp,编码580个氨基酸。根据克隆获得的全长c DNA序列设计引物,从新蔡选抗DNA中克隆获得Si PDS基因的全长DNA,长度为5 592 bp,转录区包括14个外显子和13个内含子。序列分析表明,Si PDS与其他植物的PDS蛋白序列高度相似;系统进化树分析表明,芝麻Si PDS与黄芩的亲缘关系最近。Si PDS基因可以用作植物病毒诱导的基因沉默载体的内源检测基因,在利用基因工程技术改良芝麻农艺性状方面具有较大的应用价值。     

两个烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆和表达分析

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白特有的重复保守序列LXXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX。对PGIP基因在烟草不同组织表达量分析发现,两基因在根、茎、叶和芽中均有表达,其中均在茎中表达量最高,其次是根,叶中表达量很低。     

野生稻种质在水稻抗虫育种上的研究及应用进展

本研究综合了国内外抗虫研究相关文献,主要介绍了野生稻在抗褐飞虱、白背飞虱与灰飞虱抗虫基因的遗传定位与克隆,以及在常规育种、单个抗虫基因分子标记辅助育种、多个抗性基因聚合育种上的研究进展,并讨论了野生稻优异抗虫基因在水稻遗传育种上存在的问题和发展建议。     

棉花肉桂醇脱氢酶基因的克隆与分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成过程中的一个关键酶类。根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的肉桂醇脱氢酶基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个CAD基因,命名为GhCAD5(GenBank登录号为FJ848868)。研究结果表明:GhCAD5全长1488bp,具有一个1068bp的开放阅读框,5′非编码区为140bp,3′非编码区为280bp,编码355个氨基酸,预测分子量约为38.403kDa,等电点为7.67。氨基酸同源性分析发现,GhCAD5与拟南芥AtCAD1和水稻OsCAD4的同源性较高。利用PCR方法克隆了GhCAD5基因的基因组序列,长度为1695bp,包含6个外显子和5个内含子。将GhCAD5的ORF连接于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导,获得了相应蛋白的表达。棉花GhCAD5基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。     

陆地棉Dirigent-like基因(GhDIR)的克隆与分析

Dirigent-like基因(DIR)编码蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.本研究以抑制差减杂交( SSH)技术获得DIR的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为768 bp的DIR基因cDNA全长,将该基因命名为GhDIR.该基因序列的开放阅读框(ORF)位于70 ～...     

异附加系小麦过氧化物还原酶基因TaPrxQ的克隆与序列分析

本研究依据消减结果克隆得到山农6306编码过氧化物还原酶TaPrxQ的cDNA序列,利用生物信息学工具对其核酸和蛋白序列进行分析。结果表明克隆得到的TaPrxQ序列与基因组DNA对比分析得到的该基因不含有内含子,全长943bp。TaPrxQ的cDNA序列包含927bp的开放阅读框,编码308个氨基酸残基,其等电点为9.41,分子量32.4kDa。相似性比对分析显示TaPrxQ同已报道的HvPrx的氨基酸序列具相似性达到88%,从进化树分析结果推断TaPrxQ属于PrxQ类。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

大青杨纤维素合酶PuCesA7基因片段的克隆及序列分析

本研究以大青杨叶片总DNA为模板,用已登录的欧洲颤杨PtrCesA7保守序列设计引物,进行TD-PCR扩增并将得到的片段克隆到pMD18-T载体中。测序结果分析表明,片段长2341bp将该基因片段命名为PuCesA7。经BLASTX比对,此片段包含6个编码区,共1248bp,编码416个氨基酸。并与欧洲颤杨的PtrCesA7基因的同源性为98%,证明克隆的片段为纤维素合酶基因。将该片段与GenBank中登录的玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、欧洲颤杨(Populus tremuloides)、新西兰辐射松(Pinups radiata D.Don)同源纤维素合酶基因序列比对并进行进化树分析。结果表明,大青杨纤维素合酶基因片段均与它们的亲缘关系较远。     

小麦类钙调素TaCML79基因的克隆和表达分析

为了研究小麦类钙调素基因的功能和在植物逆境响应中的分子机制,以电子克隆结合RT-PCR的方法,在小麦中克隆到一个类钙调素基因TaCML79。该基因的开放阅读框长度为588bp,编码的蛋白长度为195个氨基酸,推测的分子量为20.45kDa,等电点为4.6,属于酸性蛋白,具有2个典型的和一个不完整的EF-hand结构域。多序列比对和系统进化树分析表明,TaCML79与野生稻的ObCML35和水稻的OsCML10亲缘关系较近,相似性分别为84.6%和86.8%。该基因的表达在根和地上部分受到热激、NaCl、渗透和冷胁迫的诱导或抑制,初步推断该基因可能与植物抗逆有密切的关系。     

瓜类黄化褪绿病毒上海分离物外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备

利用RT-PCR技术扩增得到瓜类黄化褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)上海市嘉定分离物的外壳蛋白(coat protein,cp)。序列分析结果表明,cp基因的核苷酸序列长度为753 bp,编码250个氨基酸,与已报道的CCYV其他分离物的cp核苷酸相似性均高于95%。将此基因克隆到原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析表明,CCYV cp在大肠杆菌中可表达出含有6-His标签的分子量约46 kDa的蛋白。纯化表达蛋白后免疫家兔制备抗血清,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示,制备的抗血清可用于检测田间感病样品中的CCYV。     

春兰AGAMOUS同源基因的克隆及表达分析

为深入探索春兰(Cymbidium goeringii)中C类MADS-box基因参与春兰花器官发育调控的分子机理,用同源克隆的方法从春兰花芽中分离出两个C类MADS-box基因CygoAG1与CygoAG2。在分析其序列结构的基础上,分别检测2者在春兰不同花器官中的表达差异。序列结构分析表明:CygoAG1序列全长为831bp,包含702 bp完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码233个氨基酸和1个终止密码子;CygoAG2基因cDNA序列全长996 bp,包含705 bp完整开放阅读框,编码234个氨基酸和1个终止密码子,2个基因编码的转录因子均包含保守的MADS、K-box结构域和AG基序。分子系统发生与进化树重建结果显示:春兰CygoAG1与CygoAG2与拟南芥MADS-box基因家族中AG (AGAMOUS)基因的同源性最高。实时荧光定量分析结果表明,春兰CygoAG1基因只在花粉团、合蕊柱和子房中表达,在其它花器官及营养器官叶片中不表达,其在子房中的表达量最高。CygoAG2基因在春兰的花器官如萼片、花瓣、唇瓣、花粉团、合蕊柱和子房中均有表达,但在营养器官叶片中不表达,其在合蕊柱(雌雄蕊合生结构)中的表达量最高。CygoAG1和CygoAG2基因在春兰花器官中的表达模式呈现一定的差异。     

棉花中一个钝叶醇14α-脱甲基酶基因同源基因（GhCYP51G1）的克隆、序列特征和表达分析

为研究植物固醇在棉花纤维细胞生长发育中的作用和信号传导机制,通过筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合和分析,从陆地棉栽培品种徐州142正在发育的纤维中克隆了植物固醇合成途径的重要酶基因——钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因,命名为GhCYP51G1 (GenBank登录号为EU727154)。该基因编码486个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为55.2 kD和8.87。推导的氨基酸序列与烟草、马铃薯和葡萄等物种中CYP51家族成员有较高的同源性。而且具有钝叶醇14α-脱甲基酶序列中的典型保守结构域,如多个底物结合位点和血红素结合域。说明该克隆基因是钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因。实时定量RT-PCR的结果表明GhCYP51G1基因在快速伸长期的纤维中具有较高的表达水平,而在子叶、雌蕊和雄蕊以及开花后6 d胚珠、开花后0 d和2 d的胚珠纤维中表达水平较低。在开花后8 d的纤维细胞中GhCYP51G1的表达水平最高,这些结果说明该基因在纤维细胞的伸长生长中具有重要作用。同时在纤维生长过程中,由于生长素能够下调GhCYP51G1基因的表达,暗示植物固醇在植物激素,特别是油菜素类固醇物质和生长素的相互作用中具有一定作用。     

毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆及序列分析(英文)

β-1,3-葡聚糖酶是一种植物病程相关蛋白,在植物抵御病害中有重要作用。本研究以毛竹为实验材料,利用RACE技术,克隆毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的外显子序列,并在β-1,3-葡聚糖酶基因的编码区两端设计引物,以毛竹基因组DNA为模版扩增该基因的内含子序列。序列结果表明,该基因全长1693bp,包含两个外显子和一个内含子,命名为PheGLU(GenBank登录号GU238236)。该基因包含1个996bp的开放阅读框,编码332个氨基酸,相对分子质量为3.541×104Da,其等电点pI为6.389,是一个酸性蛋白且分泌到胞外;其中,该蛋白的二级结构中包含35.15%的α-螺旋,21.82%的β-转角,43.03%的延伸链和无规则卷曲等;三级结构同源建模预测显示,它与大麦β-1,3-葡聚糖酶(PDB number:1ghsA)具有80.4%的同源性;聚类分析显示,该基因序列与已报道的其它植物具有较的高氨基酸序列同源性。本研究为进一步鉴定毛竹β-1,3-葡聚糖酶基因的抗真菌病害能力奠定了基础。     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。