萝卜中一种新dsRNA的全长cDNA克隆及序列分析

 从一点红萝卜品种（Raphanus sativus-root cv. Yidianhong）叶片中提取dsRNA,应用SPAT方法对各dsRNA条带进行cDNA克隆并测序,除获得先前报道的5条序列（RasR1-RasR5）以外,还得到一条新的全长序列,将其定名为RasR 6（EU285027）。序列分析结果表明：RasR 6全长为1 778 bp,其正义链编码1个由502个氨基酸组成、分子量约为55.1 kDa的蛋白质。该序列与前人报道的双分病毒科5个病毒序列具有相似性,且它们均编码双分病毒科病毒的外壳蛋白(CP,Capsid protein)。核苷酸序列比对结果显示：RasR 6与同时来源于萝卜的RasR 1和RasR 2的5'UTR序列高度同源,且其3'末端具有poly A结构,而与RasR 3、RasR 4和RasR 5的UTR则没有明显的相似性。因此,我们推测RasR 6与RasR 1、RasR 2同属于双分病毒RasV 1（Raphanus sativus virus 1）,它可能与RasR 2共同编码该病毒的CP或作为RasV 1的卫星RNA存在。     

萝卜RsCYP86MF 基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

 本研究通过设计保守的基因特异引物, 运用SMART RACE RT - PCR技术从‘圆白’萝卜中获得一个细胞色素P450基因, 命名为RsCYP86M F, 其cDNA全长1818 bp, 含有1581 bp的完整开放阅读框, 编码526个氨基酸, 该基因编码的蛋白序列与白菜的细胞色素P450基因编码的氨基酸序列同源性高达90% , 且有很高的功能区段保守性; 对其可能编码的蛋白质二级结构进行预测发现, 该蛋白质具有细胞色素P450典型的保守结构域FNAGPRLCIG, 及N - 糖基化位点等结构域。     

萝卜过氧化物酶基因片段的cDNA克隆及花期表达谱分析

通过研究过氧化物酶(POD)活性在心里美萝卜花期的变化以及萝卜POD基因的结构,探讨POD的基因结构和功能之间的关系。测定了萝卜花期 不同时间各个部位中POD活性,用改进的半定量RT-PCR分析了过氧化物酶基因(Rsprx)的表达谱,并通过RT-PCR克隆过氧化物酶基因的cDNA片段。结 果表明,心里美萝卜花期不同器官中的POD活性具有明显的变化,地上部分和地下部分POD活性差异显著,在结荚期的木质部II中达到峰值（17.53± 0.35）×10³ U•g^-1(FW)。不同器官中Rsprx的表达差异明显,花蕾和荚中表达最强。从花蕾和荚中得到4个长度为400 bp左右的cDNA克隆片段,序列 比对结果显示,与棉花的花器官过氧化物酶基因Ghpod具有较高的同源性和结构相似性。因此认为POD与萝卜花期生长发育有一定的关系,且有多种 过氧化物酶基因在该过程中表达。     

柑橘钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析

 以温州蜜柑(Citrus unshiu Marc. ) 幼果cDNA第1链为模板, 参照大麦钙调蛋白基因序列(Accession No. M27303) 合成5p端和3p端引物, 以PCR的方法扩增得到柑橘钙调蛋白cDNA, 将其克隆到PMD182T载体上并进行测序。序列分析表明, 柑橘钙调蛋白cDNA全长453 bp, 共编码148个氨基酸, 与大麦和大豆钙调蛋白基因的同源性均高达83%以上, 所编码氨基酸序列同源性达97%以上。以该cDNA作探针进行点杂交, 得到良好的杂交信号。     

香蕉果实果胶裂解酶基因cDNA克隆及序列分析

利用已报道果胶裂解酶基因的保守序列设计简并引物,进行RT-PCR,得到1个大约1300bp的香蕉果胶裂解酶基因cDNA片段,命名为MA-pl。DNA序列分析表明:MA-pl片段全长1277bp,包含1个882bp的开放读码框(ORF),编码294个氨基酸;其具有所有果胶裂解酶共有的保守区域:钙协调部位(Asp72,Asp74,Asp96,andAsp100)、酶活性位点(Arg152,Pro154,Arg157)及3个重要的结构域(motifI:WVDH,motifII:DGLVDAVMGSTAITVSNNYF,motifIII:LYQRMPRCRHGYFHVVWNDY);MA-pl氨基酸序列与草莓-1、葡萄、草莓-2、拟南芥、苹果、香蕉(banana-1)的相似性分别为85.8%、74.2%、79.7%、78.6%、72.4%和71.4%。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

黄瓜液泡膜H+-PPass基因CuPPase的cDNA克隆、序列分析与表达

 利用GenBank 登录的植物液泡膜焦磷酸酶氨基酸保守区序列设计简并引物,利用RT-PCR 和RACE-PCR 技术从黄瓜叶片中获得了一个液泡膜H⁺-PPase 基因,命名为CuPPase,GenBank 注册号为GQ223786。CuPPase 蛋白与南瓜、绿豆同源性最高,分别为94%,92%。生物信息学分析表明,该基因全长2 650 bp,开放阅读框（ORF）2 307 bp,编码768 个氨基酸;CuPPase 蛋白大小约80 kD,理论pI值为5.32。该基因有14 个强的跨膜螺旋结构,PlantCare 分析结果显示该基因序列具有脱落酸诱导、生长素诱导、赤霉素诱导、水杨酸诱导、低温诱导、干旱诱导的顺式作用元件。RT-PCR 表明,CuPPase 在叶和根中表达较高,茎中表达较低。CuPPase表达受盐胁迫以及高温、低温胁迫诱导,但与处理时间有密切关系,其表达均表现先升高后降低的趋势。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

草莓轻型黄边病毒的RT-PCR检测及其3''端序列分析

利用RTPCR技术对草莓植株中草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的外壳蛋白基因片段进行特异扩增,扩增产物经测序证明为SMYEV的特异片段。建立了稳定的SMYEV的RTPCR检测体系,并对19个草莓品种和2种野生草莓进行检测,其中12个品种和五叶草莓带有SMYEV。从SMYEV的沈阳分离物SY01上扩增出了932bp的基因组3末端区域,其核酸序列与国外分离物的序列同源性为86%～96%。系统进化树显示SMYEV分为3个组群,沈阳分离物SY01与欧美分离物位于同一组群内,但独立形成1个小的分支。RNA二级结构分析显示SMYEV基因组3末端形成3个茎环结构,不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。     

香蕉束顶病毒DNA组分的克隆及其重要特征序列分析(英文)

克隆得到1条新的香蕉束顶病毒(BBTV)6核苷酸全序列,对其进行序列分析发现,该序列含有2个主要的特征序列CR-SL(Stem-loop common regions)和CR-M(Major common regions)。BBTV6氨基酸进化树结果显示其分成2大类。将6种BBTV组分的序列进行比较发现,6种组分内核苷酸和氨基酸的最高相似性分别为96.10%和98.27%,6种组分间核苷酸和氨基酸最高相似性分别为70.78%和56.24%。6种BBTV组分的核苷酸及其氨基酸进化树将所有分离物按照组分类别分成6组,而6种BBTV组分的CR-M核苷酸序列进化树将所有的分离物按照地域分成2大类。对BBTV的6种组分的蛋白质进行分析,结果表明,各种组分蛋白质的二级结构和理化性质有明显的差异。     

草莓轻型黄边病毒的RT-PCR检测及其3'端序列分析

 利用RT-PCR技术对草莓植株中草莓轻型黄边病毒( SMYEV) 的外壳蛋白基因片段进行特异扩增, 扩增产物经测序证明为SMYEV的特异片段。建立了稳定的SMYEV的RT2PCR检测体系, 并对19个草莓品种和2种野生草莓进行检测, 其中12个品种和五叶草莓带有SMYEV。从SMYEV 的沈阳分离物SY01上扩增出了932 bp的基因组3'末端区域, 其核酸序列与国外分离物的序列同源性为86% ～96%。系统进化树显示SMYEV分为3个组群, 沈阳分离物SY01与欧美分离物位于同一组群内, 但独立形成1个小的分支。RNA二级结构分析显示SMYEV基因组3'末端形成3个茎环结构, 不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。     

甜菜BvCK2基因全长cDNA的克隆和序列分析

甜菜M14品系在细胞胚胎学和遗传学特征上具有鲜明的无融合生殖现象。为了寻找在这一特殊的生殖过程中的相关基因及其调控作用．实验通过同源克隆及cDNA末端快速扩增（RACE）的方法,首次从甜菜M14品系中克隆了与生殖相关的基因ByCK2（Beta vulgaris casein kinase2）的全长cDNA序列．长度为1501bp,开放阅读框为1002bp,编码333个氨基酸。根据氨基酸序列计算蛋白分子量为39．28kDa,pI=8．16。同源比对表明,ByCK2与烟草CK2（Ge．nBankNo．A1437635）的相似度为64.22％,与百合CK2（GenBankNo．AF517838）的相似度为65．18％。通过细胞内定位分析．ByCK2所编码的蛋白主要存在于细胞核中。     

萝卜病毒病小RNA 分析及资源抗性表现

病毒病是为害萝卜的主要病害之一。基于核酸检测的植物病毒病检测技术，因其检测范围广、灵敏度高、适合大批 量检测而得以广泛应用。本试验利用小RNA 高通量测序方法鉴定萝卜病毒病的种类，并调查分析了264 份萝卜核心种质资 源及育种品系对病毒病的抗性。结果表明：萝卜病毒病的主要病原为芜菁花叶病毒（TuMV）。参试的核心种质资源和品系 多数表现出较好的抗性，且不同品系姊妹系间抗性表现基本趋于一致。田间抗病性调查结果显示：抗病材料有103 份，高抗 材料有64 份，且有25 份材料达到免疫。     

柑橘黄化脉明病毒基因组的长链RT-PCR扩增、克隆及序列分析

为了建立柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)基因组长链RT-PCR扩增体系,构建其全长cDNA克隆,为深入了解CYVCV分子特性及其致病机理奠定基础。根据GenBank中CYVCV基因组序列和5′RACE扩增结果设计引物。以感染CYVCV的代代酸橙(Citrus aurantium‘Daidai’)植株总RNA为模板进行长链RT-PCR扩增,得到CYVCV全基因组cDNA,克隆至pGEM-Teasy载体,并进行序列测定与分析。结果显示,建立了一步扩增CYVCV全基因组的长链RT-PCR方法,扩增出约7.5 kb的目标片段;所获得的4个CYVCV全基因组cDNA序列与GenBank中已登录的相关毒株的核苷酸序列同源性为93%~99%。     

枳根cDNA全长文库的构建与分析

为了解柑橘优良砧木枳（Poncirus trifoliata）根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长cDNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08 × 106 cfu ? mL-1,扩增后文库容量为1.30 × 109 cfu ? mL-1,重组率为95%。通过文库随机测序获得182个长度大于100 bp的ESTs序列（GenBank登录号为JK316116 ~ JK316297）,序列拼接后得到96个Unigenes,包括12个Contigs和84个singletons。其中,68个Unigenes可与GenBank中登录的基因相匹配,56个与已知的柑橘基因相匹配,36个为全长基因。对24个全长基因完成了功能注释,并进一步开展了生物信息学分析,发现有6个应激反应基因和3个根发育相关基因。     

香蕉果皮2个HSP70基因片段的克隆及其在热激和冷藏过程中的表达

温度逆境胁迫可以诱导热激蛋白的表达,而热激处理能够减轻果实冷害。为了探讨温度逆境对香蕉热激蛋白基因表达的调控、辨析香蕉热激蛋白基因的表达与果实冷害的关系,采用同源序列法分离了香蕉果皮HSP70基因序列-根据已经报道的HSP70基因的氨基酸保守序列设计引物、以香蕉果皮总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆香蕉的HSP70 cDNA,Northern杂交分析该基因在不同贮藏温度下的表达特征。结果得到2个序列不同的HSP70基因片段,分别命名为Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2,Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2之间的碱基同源性为86.9%,氨基酸同源性为97.1%。Northern杂交的结果表明,38℃短期热激处理诱导了Ma-HSP70-2基因的表达,低温冷藏能使2个基因的表达增强。并初步认为Ma-HSP70可能与香蕉果实耐冷性有关。