仔猪腹泻源大肠杆菌贵州株K88菌毛研究

通过玻片凝集试验、抗Ｄ－甘露糖微量血凝试验（ＭＲＭＨ）、离体细胞粘附试验、菌体蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和免疫印迹、质粒ＤＮ民泳等。分析了仔猪腹泻源大砀杆菌贵州株（４０９－１１）所产Ｋ８８菌毛的血凝谱、对肠上皮细胞粘附特性、菌毛蛋白单位分子量,并对其Ｋ８８基因进行了初步定位。结果表明：其所产Ｋ８８菌毛的血凝谱能凝集豚鼠和允许红细胞;能介导细菌粘会于仔猪离体肠上皮细胞,这种粘附作用     

鸽源致病性大肠杆菌O44K88菌株的分离鉴定及生物特性研究

从鸽中首次分离出具有Ｏ４４和Ｋ８８怕的Ｏ４４：Ｋ８８血清型菌株，并对其进行了是及生物特性研究，表明该菌株具有广泛的致病性，菌株表现为不溶血、ＨＡ、ＭＳＨＡ、ＳＡＴ、刚果红试验阳性     

动物性食品中O157：H7大肠杆菌污染及防止措施

O_(157):H_7大肠杆菌(Eschericha coli O_(157):H_7)是肠出血性大肠杆菌的最主要的一种血清型。对人的致病性很强。该菌污染动物性食品后随食物进入人体,引起出血性肠炎,导致出血性肠炎。 1.国内外流行情况 近年来由于O_(157):H_7大肠杆菌污染食品导致食用者感染的情况较为多见。在1982年美国发生了两起该菌食物中毒事件,有19人死亡,该事件是由当地一家快餐店售出的汉堡包中牛肉饼受O_(157):H_7大肠杆菌污染所致。在1983年美国西部地区也发     

宠物源大肠杆菌的血清型和毒力基因及耐药性调查

为研究宠物源致病性大肠杆菌(Escherichia coli)的血清型、毒力基因和耐药性之间的相关性,本研究由健康和患病犬、猫直肠拭子样品中分离177株E.coli,并采用玻片凝集法鉴定其血清型,结果显示分离株中定型菌株135株,分别属于20个不同的血清型,其中O1、O2和O8为主要的流行血清型。PCR方法检测11种毒力相关基因,并采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药的敏感性,结果表明3个血清型的菌株拥有相似的耐药表型,但毒力基因谱不同。62%的分离菌株携带fimH基因,并且毒力基因组合iroN+hlyF、iroN+fimH和traT+sitA比较流行。55%的O1血清型携带fimH基因,并且多数耐受四环素、多西环素、头孢噻吩和庆大霉素;20.8%的O2血清型菌株携带traT和sitA基因;50%的O8血清型携带traT和fimH基因。3个血清型分离菌株多数对安普霉素和阿米卡星敏感。     

羊源大肠杆菌血清型鉴定、毒力基因检测及耐药性分析

为分析内蒙古扎兰屯地区羊源大肠杆菌血清型分布、毒力基因及耐药性流行情况,采集患羊鼻腔拭子150份,分离大肠杆菌,并采用O血清型玻板凝集试验、PCR法和K-B药敏纸片法对分离的大肠杆菌致病菌株进行血清型、毒力基因及耐药性检测。结果显示, 45株大肠杆菌致病菌株分属10种血清型,以O111、O127、 O38为流行的优势血清型,分别占致病菌株的26.7%、22.2%和17.8%;分离菌株毒力基因irp2、fyuA、hlyA、hlyE、Ler、eaeA、Ehly检出率在33.3%以上,其他毒力基因检出率在4.4%～14.3%之间;分离菌株对氨苄西林、阿莫西林、新霉素9种药物耐药率在53.3%以上,对其他药物的耐药率在13.3%～26.7%之间。研究表明,内蒙古扎兰屯地区羊源大肠杆菌血清型复杂,携带多种毒力基因,耐药性严重。     

产肠毒素大肠杆菌K88ab/K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性的初步研究

为研究K88ab/K88ad菌毛对细胞的黏附作用,本研究分别以产肠毒素E.coli (ETEC) K88ab C83901株和K88ad C83903株基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增这两种K88菌毛操纵子fae基因(均约7.9 kb).将其分别克隆于表达质粒pBR322中构建pBR-K88ab和pBR-K88ad重组质粒,并将其分别转化至不含任何菌毛的E.coli SE5000株中.该重组菌能够分别与鼠抗K88菌毛阳性血清和抗K88菌毛单克隆抗体(MAb)产生凝集反应;在电镜下观察到重组菌表面大量表达K88菌毛.采用热抽提法提取其体外表达的K88ab和K88ad菌毛,SDS-PAGE电泳检测结果显示,菌毛蛋白的分子量约为26 ku.玻板凝集试验和western blot结果表明:重组表达的K88ab及K88ad菌毛与K88+参考株菌毛均能够被抗K88菌毛阳性血清和MAb识别.以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型进行黏附和黏附抑制试验,结果表明表达K88菌毛的重组菌及K88+参考株均能够黏附于IPEC-J2上皮细胞表面;而且阳性血清和MAb能够有效抑制重组菌或K88+参考株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合.     

华东地区部分猪源大肠杆菌K88黏附素的生物学特性

近年来，从华东地区患腹泻仔猪中分离到一些表达K88菌毛的大肠杆菌，这些菌株只与K88a因子单抗反应，而不与b、c、d因子单抗反应。通过K88常规血清交叉吸收试验、SDS-PAGE、Western印迹，表明这些菌株不仅与K88ac参考菌株C83907制备的c因子血清反应，而且与以分离株SEC586制备且经K88ab、K88ac、K88ad参考菌株吸收后的血清也反应。对分离株SEC586、SEC464的K88主要亚单位结构基因faeG的克隆、测序，发现该基因由846对核苷酸组成，编码菌毛主要亚单位的262个氨基酸及21个氨基酸的信号肽，比国外报道的K88ac FaeG亚单位（263个氨基酸）少了1个氨基酸，比K88ab、K88ad（265个氨基酸）少了3个氨基酸。SEC586、SEC464菌株的FaeG亚单位氨基酸序列的同源性为97．7％，它们与K88ac的同源性为94．7％和96．2％；与K88ab的同源性为90．1％和91．2％；与K88ad的同源性为87．0％和88，6％。结果表明，新分离的K88ac大肠杆菌黏附素主要亚单位已发生了部分变异。     

检测K88~+肠毒素性大肠杆菌PCR方法的建立

以K8 8菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了一对可扩增长 2 0 1bp的目的片段的引物 ,成功地建立了检测肠毒素性大肠杆菌(ETEC)K88菌毛基因的PCR方法。进行了PCR方法的特异性试验和敏感性试验。对K99+ ,F41 + ,987p+ 参考菌株和鼠伤寒沙门氏杆菌 ,链球菌 ,金黄色葡萄球菌和猪肺疫巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该检测方法的敏感度可达 1 0个细菌。用此方法对 1 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,结果有 2株阳性 ;与血清学检测的结果一致。结果表明此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床K88+ 肠毒素性大肠杆菌病的快速诊断和流行病学调查     

苏中地区猪大肠杆菌病血清型鉴定及毒力基因的调查

无菌采集苏中地区兽医站、养殖场、动物医院疑似大肠杆菌感染的病死猪的有明显病变的肝、心、脾、肺等病料413份。通过细菌的分离培养,并进行生化试验和血清型鉴定,共分离到208株大肠杆菌,共鉴定出145株的的血清型,63株未能定型,定型菌株分别属于19种不同的血清型,同时对签定出的145株猪源大肠杆菌进行毒力基因检测,发现苏中地区猪大肠杆菌所含的毒力基因为含estⅡ的占50.3%,含estⅠ的占39.3%,含LT的占30.3%,含毒力基因Stx-2e的为20.7%,含Intimin的占15.9%。其中estⅠ和estⅡ较为流行。     

大肠杆菌K88纤毛抗原的提纯和抗血清的制备

以5％绵羊血改良Minca琼脂筛选和克隆表达良好的K88^＋菌株，改良Minca琼脂培养获得K88菌液。用加热法及高速匀浆法使K88纤毛从菌体上脱下。饱和硫酸铵沉淀粗提，用Sepharose CL-4B凝胶过滤纯化K88抗原。提纯的抗原经SDS—PAGE电泳测定其分子量约为25000，且仅此一条蛋白带；与K88抗血清进行琼脂扩散试验只出现一条沉淀线。用提纯的抗原经多次免疫家兔制备了K88抗血清。抗血清在玻板凝集试验中只凝集K88菌株，不凝集K99，987P或F41菌株；在琼扩试验中，只与K88粗提抗原出现一条沉淀线，且效价为1：64，而不与K99，987P抗原出现沉淀线；在免疫电泳试验中，与无细胞K88纤毛液只出现一条沉淀线。鉴定结果表明，所制备的K88血清特异性强、效价高，可作为单因子血清用于凝集试验、琼扩试验等血清学试验，对K88菌株进行鉴定，对K88纤毛抗原进行定性和定量检测。     

鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析

自规模化养鸭场患典型大肠杆菌败血症雏鸭分离的282株致病性大肠杆菌（E.coli）中鉴定出210株（包含37种血清型）,其中O93、O78、O92、O76占43.8%（92/210）为优势血清型,O46、O32＆O93混合型、O60＆O93混合型为首次从鸭群中分离到。应用PCR结合核酸序列测定对210株致病性E.coli（鸭大肠杆菌病分离株）和28株自健康雏鸭泄殖腔拭子分离的E.coli（临床健康鸭大肠杆菌分离株）进行包括强毒力岛（HPI）中的鼠疫菌素受体基因（fyuA）和铁调节蛋白基因（irp2）、Ⅰ型菌毛必需蛋白基因（fimC）、P型菌毛结构基因（papA）和血清耐受基因（iss）检测,结果表明：fyuAi、rp2、fimC、papA和iss基因在鸭大肠杆菌病分离株的携带率分别为41.0%、43.3%、92.9%、97.6%和96.7%,在临床健康鸭大肠杆菌分离株的携带率分别为21.4%、25.0%、92.9%、100%和92.9%,患病鸭和临床健康鸭大肠杆菌分离株iss、fimC和papA携带率差异不显著（P〉0.05）,但papA的携带率均显著高于其他宿主（鸡、猪和人）源E.coli;HPI毒力岛在鸭源E.coli中分布较广,其携带率表现为鸭大肠杆菌病分离株极显著高于临床健康鸭大肠杆菌分离株。HPI毒力岛的携带率与菌株的致病性呈明显的正相关,与O78等特定的血清型有一定的关系。鸭大肠杆菌病分离株有37.6%（79/210）同时携带fyuAi、rp2、fimCi、ss和papA基因,极显著高于健康鸭大肠杆菌分离株的14.3%（4/28）（P〈0.01）。     

致病性大肠杆菌血清型的鉴定与药敏试验

在锦州地区发病鸡群中采集病料,经血清型鉴定为O78型。通过对这种致病性大肠杆菌进行药敏试验,发现在9种受试药物中,极度敏感的药物有一种为丁胺卡那霉素;高度敏感的药物有两种分别为环丙沙星、庆大霉素;该菌种已对其他六种药物产生了耐药性。该试验结果将对锦州地区肉鸡大肠杆菌病的防治具有一定的参考价值。     

宁夏部分地区鸡大肠埃希菌的分离与血清型鉴定

为调查宁夏地区鸡大肠杆菌病的流行情况,采集宁夏4个地区的103个规模化鸡场疑似病料151份,通过病原菌分离鉴定及生化试验,鉴定出鸡大肠埃希菌109株,平均分离率为72.19%(109/151);动物试验证实,59株分离菌有致病性,占分离菌54.13%(59/109);对致病性菌株进行血清型鉴定,确定血清型种类13种38株,占致病性菌株64.41%(38/59);优势血清型分别为O15、O18、O78、O88,占定型菌株63.16%(24/38)。     

Molecular Mechanism of the Inflammatory Response Induced by Enterotrxigenic E. coli K88 in Piglets

To investigate the molecular mechanism of the inflammatory response in the piglets infected with enterotoxigenic E. coli (ETEC) K88, piglets were infected with ETEC K88,the IL-8 content in serum of piglets were assayed by ELISA,and the mRNA relative expression levels of TLR2/4 and its signal transduction pathway related genes (MyD88,Tollip and Bcl3) in mesenteric lymph nodes were detected by quantitative Real-time PCR. The results showed that compared with control group,the content of IL-8 in serum and the expressions of TLR2/4 in lymph nodes were all extremely significantly or significantly increased at 6 and 24 h after infection (P<0.01;P<0.05),and the IL-8 content and TLR2/4 mRNA expression at 24 h after infection were all significantly lower than those at 6 h after infection (P<0.05).In addition,the expressions of MyD88,Tollip and Bcl3 in lymph nodes were all extremely significantly increased at 24 h after infection compared with control group (P<0.01), but there was no significant difference between experimental group and control group at 6 h after infection (P>0.05). In conclusion,ETEC K88 infected piglets might produce inflammatory cytokines IL-8 through the TLR2/4-MyD88 signaling pathway,which could promote the inflammatory reaction in piglets. This inflammatory response might be regulated by Tollip and Bcl3,which could weak the inflammatory intensity in piglets.     

产肠毒素大肠杆菌K88诱导仔猪炎症反应的分子机制

为探讨产肠毒素大肠杆菌（ETEC） K88感染仔猪发生炎症反应的分子机制,试验用ETEC K88灌服断奶仔猪,ELISA法检测攻毒后仔猪血清中白细胞介素8（IL-8）含量,实时荧光定量PCR方法检测淋巴结中Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）及其信号通路相关基因（髓样分化因子88（MyD88）、Toll相互作用蛋白（Tollip）、B细胞淋巴瘤因子3（Bcl3））的mRNA相对表达水平。结果发现,仔猪攻毒ETEC K88后6和24 h血清IL-8含量和淋巴结TLR2/4的表达水平均极显著或显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,且感染后24 h显著低于感染后6 h（P<0.05）;仔猪感染ETEC K88后24 h淋巴结中MyD88、Tollip和Bcl3的表达水平均极显著高于对照组（P<0.01）,但是感染后6 h时与对照组相比均无显著差异（P>0.05）。综上所述,ETEC K88感染仔猪可能是通过TLR2/4-MyD88信号通路产生炎症因子IL-8,促使仔猪出现炎症反应,且该炎症反应可能受Tollip和Bcl3蛋白的调控而被减弱。     

产肠毒素大肠杆菌双重PCR检测方法的建立

为了快速检测和鉴定产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88和K99)基因,本研究设计合成了针对K88、K99的2对特异性引物,对扩增条件进行优化,建立了检测K88和K99的双重PCR方法。该方法对K88、K99基因的扩增产物大小分别为237和314 bp;最终确定dNTP终浓度0.4 mmol/L,K88、K99的引物终浓度均为25 μmol/L,退火温度为52℃。试验结果表明,该方法具有良好的灵敏性和特异性。用所建立的双重PCR方法对实验室分离的23株大肠杆菌进行检测,结果显示,K88单重PCR阳性2株,K99单重PCR阳性3株,K88和K99双重PCR阳性5株。本研究建立的双重PCR检测方法为致幼畜腹泻产肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供了方法。     

Isolation and Identification of E. coli in the Microbial-fermentation Bed of Piggery

To investigate the distribution and characteristic of E. coli in the microbial-fermentation bed of piggery, litters with different levels of fermentation were used for the isolation, identification and drug sensitivity test of E. coli, to analyze the pathogenicity and drug susceptibility of E. coli in the microbial-fermentation bed of piggery. The results showed that, E. coli could be isolated only from litters with low degree of fermentation (0<△E≤7.63), and totally 41 strains were isolated from litters with 10^-5 dilution, but none from litters with higher degree of fermentation (△E>7.63). The number of E. coli reduced along with the fermentation of litters. Among the 41 strains of E. coli, 15 were intestinal pathogenic strains, 9 of which had astA gene (22%), and 2 strains had sepA gene (4.8%). 11 strains were resistant to doxycycline, accounted for 27% of the total.The two strains containing sepA gene had strong resistance to doxycycline. In conclusion, the microbial-fermentation bed fermentation bed had a inhibitory effect on E. coli which promoted the application of fermentation bed and reusing of litters.     

微生物发酵床猪舍不同发酵等级垫料中大肠杆菌的分离鉴定

为了研究微生物发酵床不同发酵等级垫料中大肠杆菌的分布及其特性,试验采集了微生物发酵床猪舍不同发酵程度的垫料,进行大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验,分析了发酵床中大肠杆菌的致病性和抗生素抗性。试验结果表明,在10^-5稀释倍数下,仅在垫料发酵级别为一级的垫料中,即垫料使用时间较短、发酵程度较低（0<△E≤7.63）的条件下,分离到41株大肠杆菌;而在发酵程度较高的垫料中,即垫料发酵程度二级以上（△E>7.63）的环境中未分离到大肠杆菌。随着发酵的进行,发酵床中大肠杆菌数量逐渐减少。41株大肠杆菌中含有致泻性大肠杆菌15株,其中具有热稳定肠毒素（astA）基因的大肠杆菌9株,占总数的22%,含耐药性因子（sepA）基因的大肠杆菌2株,占总数的4.8%;耐强力霉素的大肠杆菌11株,占总数的27%。含有sepA基因的大肠杆菌具有强耐药性。从以上结果来看,微生物发酵床对猪舍大肠杆菌具有抑制作用,可为发酵床的推广应用及垫料再利用提供一定依据。     

动物源E.coli O157∶H7 stx基因的检测与系统进化分析

为了解2009－2010年间在河南、甘肃地区分离鉴定的5株大肠埃希菌O157(E.coli O157)携带stx的情况及不同分离株间stx分子进化与变迁的情况,本研究利用PCR方法对分离株进行了stx基因检测,并完成了序列测定与系统演化分析。结果表明,5株不同动物源的分离株均含有stx1及stx2基因。序列分析结果显示5株分离株间stx1、stx2的核苷酸及氨基酸同源性均较高;stx1基因均与参考株中的山羊源和食品源E.coli O157菌株的同源性较高,进化树中遗传距离最近;分离株的stx2基因与多株牛源及少数人源参考株也具有较高的同源性,进化树中虽然5株分离菌均在一个大主干分支中,但分离株27与其他各分离株及参照株遗传距离最远,独自处于一次级分支中;分离株L37与W、12与50分别分布于牛源、人源E.coli O157小次级分支中;由此可推测,分离株所携带的stx1很有可能是经食品源或羊源E.coli O157传递而来;分离株L37与W、分离株12与50的stx2可能是由牛源、人源E .coli O157菌株传递而来,分离株27的stx2来源不清楚。研究结果表明,5株E.coli O157分离株均含有stx1、stx2基因,但两个基因的起源存在差异。