小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术,从小鼠基因组中克隆了1.6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5′上游调控序列,经酶切和测序证实与已知序列基本一致.为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达,将此序列与报告基因CAT融合,构建了pWAP-CAT-polyA乳腺定位表达载体,脂质体包裹后,经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达.分别于家兔分娩后1～10 d采奶,用ELISA检测乳汁中CAT含量.结果表明,所构建的载体在家兔乳腺中能够表达,表达水平在家免分娩后1～5 d较高.     

牛BLG/hEPO和大鼠WAP/hEPO基因在家兔乳腺中的表达

将人红细胞生成素 (h EPO)基因组 DNA(g DNA)与 1.1kb牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因的 5′端上游调控序列融合 ,构建了 p CMV- BL G- EPO- b GH poly A(p CBEA)乳腺定位表达载体。该载体与已构建的大鼠乳清酸蛋白 (WAP)基因 5′端上游调控序列和 h EPO融合基因 p WAP- EPO- WAP3′U TR(p WE3′)和 p CMV- WAP- EPO- b GH poly A (p CWEA )经脂质体包裹后 ,通过显微外科方法 ,经乳腺导管注入妊娠中后期家兔乳腺内 ,进行短暂表达。于家兔分娩后 1～ 2 5 d采奶 ,EL ISA检测乳汁中 EPO含量 ,3个载体均获得表达。表达水平从高到低依次为 p CWEA、p CBEA、p WE3′;表达量为 0 .116～ 0 .75 3μg/ L ,且表达一直持续整个泌乳期     

牛BLG／tPA和牛as1酪蛋白／tPA基因在家兔乳腺中的暂时表达

为鉴定和筛选用于制备tPA转基因动物乳腺生物反应器的高效表达载体，试验分别以1.1kb牛b-乳球蛋白（BLG）基因，1．0kb牛asl酪蛋白基因5'端侧翼调控序列与1．7kb经过改造的人组织纤溶酶原激活剂（tPA)cDNA融合，构建了pBLG-PA2和pasl-PA22个乳腺定位表达载体。载体经酶切鉴定正确后，用脂质体包裹，并用毛细玻璃管经乳头管导入妊娠中后期的家兔乳腺，进行暂时表达。分别于家兔分娩后1－15d采奶，采用琼脂糖平板溶圈法测定乳汁中tPA的含量和活性。结果2个载体均获得表达，且pBLG-PA2表达水平高于pasl-PA2。pBLG-PA2和pasl-PA2在家兔乳汁中的含量分别为200－850μg/Lt 50-250μg/L。     

hEPO乳腺定位表达载体的构建及其在大鼠和家兔乳腺中的暂时表达

将人红细胞生成素（ｈＥＰＯ）基因组ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）与大鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的上游调控序列融合,分别构建了ＰＷＡＰＥＰＯ－ＷＡＰ３‘ＵＴＲ（ＰＷＥ３’）和ＰＣＭＶ－ＷＡＰ－ＥＰＯ－ＢＨＧｐｏｌｙ（ｐＣＷＥＡ）２个乳腺中位表达载体,表达载体经脂质体包裹后,以显微外科方法,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠和家兔腺内,进行暂时表达。分别大于分娩后４８、７２ｈ,家兔分娩后１－１０ｄ采奶,ＥＬＩＳＡ方法检     

鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达

将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合，构建了pCAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因5′调控序列）表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液，转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明，在鸡原代输卵管上皮细胞，转染后48h表达量最高，为0．67μg/L;而在鸡成纤维细胞，不论有无类固醇激素存在，均不表达。结果提示，在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。     

牛BLG基因5’调控序列控制GFP基因在原代乳腺上皮细胞中的表达

采用胶原酶分阶段消化法对家兔的原代乳腺上皮细胞进行了分离培养，并且构建了以牛ヂ-乳球蛋白(BLG)基因5，调控序列为启动子、以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因的真核表达载体。将该载体转染兔原代乳腺上皮细胞，然后用不同质量浓度的皮质醇、胰岛素和催乳素诱导。结果表明，用5mg／L催乳素 5mg／L胰岛素 1mg／L皮质醇诱导，在诱导36h后开始有荧光出现。诱导48～60h时荧光更强一些，而未经诱导的细胞GFP则不表达。     

抗菌肽天蚕素B基因的克隆及其在山羊乳腺中的暂态表达

根据已发表的天蚕素B的cDNA序列化学合成4务引物,以重叠延伸PCR的方法合成了真核细胞偏爱密码子编码的抗菌肽天蚕素B基因,将其克隆于pMD18-T栽体,DNA序列分析证实合成的抗菌肽基因的碱基序列与设计的序列完全一致.利用山羊-β酪蛋白基因5'侧翼调控序列和真核基因表达栽体plRES1-neo,构建抗菌肽天蚕素B的乳腺组织特异性表达载体pbCP-cpin,将该载体溶于生理盐水,注入处于泌乳期的成年母山羊乳腺组织进行暂时表达.通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌试验确定了抗菌肽天蚕素B基因在山羊乳腺中的表达和抗菌活性.本试验建立了抗菌肽天蚕素B的乳腺瞬时表达系统,为验证各调控元件以及抗菌肽基因在转基因动物乳汁中分泌表达的有效性和可行性提供了一个快速检测系统.     

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

乳蛋白基因的表达调控及其应用

近年来，乳蛋白基因在乳腺组织的高效、特异性表达的调节机制是人们研究的热点。随着研究的不断深入，其调控序列的结构已日渐清楚，而利用其调控序列构建乳腺特异性表达载体也成为人们关注的焦点。现就乳蛋白基因的表达调控及应用其构建乳腺生物反应器表达载体的研究概况作一综述。     

牛BLG基因5′调控序列控制GFP基因在原代乳腺上皮细胞中的表达

采用胶原酶分阶段消化法对家兔的原代乳腺上皮细胞进行了分离培养 ,并且构建了以牛 β-乳球蛋白 (BL G)基因5′调控序列为启动子、以绿色荧光蛋白 (GFP)基因为报告基因的真核表达载体。将该载体转染兔原代乳腺上皮细胞 ,然后用不同质量浓度的皮质醇、胰岛素和催乳素诱导。结果表明 ,用 5 mg/ L 催乳素 5 mg/ L 胰岛素 1m g/ L 皮质醇诱导 ,在诱导 36 h后开始有荧光出现 ,诱导 4 8～ 6 0 h时荧光更强一些 ,而未经诱导的细胞 GFP则不表达     

多个顺式作用元件调控t-PAcDNA乳腺定位表达

由牛 β-酪蛋白 ( β-Casein)启动子与大鼠乳清酸蛋白 ( WAP)启动子融合及串联构建成 2个组织纤溶酶原激活剂 ( t-PA) c DNA乳腺定位表达载体 p SVL-βΔWAP-PA和 p SVL-WAPβ-PA。将这 2种表达质粒分别注入怀孕家兔乳腺导管中 ,溶圈试验结果显示 ,2种质粒均能在家兔乳腺中表达 ,且以分娩后第 5天的乳汁中表达水平最高 ,分别为 70 0 μg/ L和 50 0 μg/ L。本试验为进一步研究 t-PA基因乳腺定位表达调控和建立 t-PA乳腺生物反应器奠定了基础     

山羊β-酪蛋白启动子指导的通用表达载体及乳腺暂时表达系统

为了实现外源蛋白在动物乳腺中的特异性高效表达，利用山羊β-酪蛋白5’端1．132kb的侧翼调控序列、牛生长激素基因polyA(BGHPA)序列、基质结合区(matrixattac}linentregion，MAR)和多克隆住点(MCS)，构建了乳腺组织定位通用表达裁体pMRPA，鉴定正确后，将2．1kb的人组织型纤溶酶原激活荆(tissue—type plasminogen activator，tPA)cDNA克隆到pMRPA多克隆位点，获得重组表达载体pMRPA—tPA。在不同的泌乳时间，使用不同的包裹剂，采用不同的剂量，将pMRPA—tPA注入泌乳期山羊乳腺组织进行暂时表达。结果显示，所构建的乳腺组织特异性通用表达载体能够有效地指导目的基因的高效表达。通过乳腺暂时表达试验进一步发现，泌乳稳定期表达效果最好，tPA表达水平在2．020～6．959mg／L；表达量随DNA用量的增加而提高；使用普通包裹剂和裸质粒相比，普通包裹剂对表达效果无明显影响。本试验对乳腺暂时表达系统进行了系统性研究，为通过乳腺暂时表达系统改良乳汁蛋白组成提供了重要依据。     

山羊BLG基因侧翼区的克隆及序列分析

克隆奶山羊β-乳球蛋白基因5′、3′调控区并对其进行序列分析。从徐淮奶山羊组织中提取基因组DNA,采用高保真长模板PCR法克隆得到山羊β-乳球蛋白基因4.2 kb的5′调控区和1.8 kb的3′调控区。将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定和序列测定验证克隆的正确性。部分序列分析表明,5′区与GenBank中登录的山羊和绵羊BLG基因5′区同源性分别为100%和95%;3′区同源性则分别为99%和93%。克隆得到的奶山羊BLG调控区与山羊BLG伪基因显著不同,5′区和3′区同源性分别为83%和88%。结果表明,克隆得到的奶山羊BLG调控区可用于构建乳腺特异性表达载体,为指导外源基因在转基因动物乳腺中的高效表达奠定了基础。     

乳腺特异的甜味蛋白Brazzein基因真核表达载体的构建

为了建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法,研究在人工合成甜味蛋白Brazzein基因的基础上,利用乳腺特异表达的pBC-1载体,构建Brazzein基因的真核表达载体。结果表明:所合成的Brazzein基因与GenBank中Brazzein序列的同源性为100%,构建的克隆载体STP-pMD18-Simple正确;将甜味蛋白Brazzein基因与pBC-1载体连接后,成功构建甜味蛋白Brazzein基因的乳腺特异性表达载体STP-pBC-1。     

破伤风毒素C片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出1356bp的破伤风毒素C片段基因，该片段是与靶细胞起结合作用的重链C端基因，经DNA序列测定分析，扩增出的基因与GenBank上登陆的序列AFl54828的同源性达到99．2％。将此基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pET-30a（＋），构建成重组表达质粒pET—TetC，并在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达，经SDS—PAGE蛋白电泳鉴定，表达产物约为50000的重组蛋白，其表达量占菌体总蛋白的33．5％，经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。动物试验证明，此重组抗原具有良好的免疫原性，能保护动物免受破伤风毒素的攻击。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）全长S基因插入pAdTrack—CMV穿梭质粒中，形成的转移质粒pAdTrack—CMV／S线性化后，用pAdEasy^TM系统电转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠埃希氏菌BJ5183，经同源重组，构建了含有全S基因的重组腺病毒载体，经酶切充分暴露反向末端重复序列后，与脂质体混合转染AD-293细胞，成功获得了AD-S复制缺陷型腺病毒，经检测证实，AD-S稳定性好，安全性高。转录水平检测证实，S基因得到了转录；荧光检测发现，外源蛋白已得到表达。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

FMDV2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达

构建FMDV 2A介导的人白细胞介素2基因(hIL-2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子乳腺特异性表达载体,并验证其在乳腺上皮细胞中的表达.克隆奶山羊β-酪蛋白启动子序列,将hIL-2基因序列置于启动子之后,然后利用口蹄疫病毒2A(FMDV 2A)自剪切序列连接EGFP基因,构建出乳腺特异性的双顺反子表达载体pFIENβ,并利用脂质体转染山羊乳腺上皮细胞,然后用RT-PCR技术和Western blot检测hIL-2基因与EGFP基因的表达.重组质粒pFIENβ经酶切鉴定后表明构建成功,转染质粒PFIENβ和pEGFP-C1的细胞均观察到绿色荧光;从转染pFIENβ的乳腺上皮细胞中扩增出hIL-2基因和EGFP基因,而转染pEGFP-C1的细胞中只扩增出EGFP基因;经Western blot检测,转染pFIENβ的细胞中均表达了hIL-2和EGFP蛋白.结果表明山羊β-酪蛋白启动子能同时启动hIL-2基因和EGFP基因在山羊乳腺上皮细胞中的表达,并且利用FMDV 2A元件实现了hIL-2基因和EGFP基因的非融合型表达.     

乳清酸蛋白基因调控序列的鉴定及转基因小鼠乳腺表达G-CSF载体的构建

乳清酸蛋白基因经亚克隆、酶切鉴定，并对该基因５′区进行克隆和序列分析，在核实序列正确后，构建了以其为调控序列、指导人Ｇ－ＣＳＦ基因的真核表达质粒，以用于转基因动物乳腺表达研究。     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增，得到了1条完整的基因，大小为642bp；测序分析证明，它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析，表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，用IPTG进行诱导。结果证实，该基因可以在大肠杆菌中表达，表达产物为分子质量约50ku的融合蛋白，与理论推测的蛋白分子质量一致；Western—blotting试验证明，表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。