象草CCR基因的克隆与生物信息学分析(英文)

[目的]从能源植物象草中克隆出参与木质素生物合成的肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)的cDNA序列及全长DNA序列,进而分析其序列特征。[方法]采用传统RT-PCR及RACE技术克隆象草CCR序列,并利用NCBI,ProtParam,ProtScale,TMHMM,TargetP,SignalP,Pfam20.0,Prosite,Swiss-Model和ClustalW2等在线分析程序以及DNAman,DNAstar和MEGA5软件对得到的序列进行生物信息学分析。[结果]克隆得到了象草CCR包含编码区和3’非翻译区的长为1316bp的cDNA序列以及包含5个外显子和4个内含子的全长为6133bp的DNA序列。通过生物信息学分析得知,象草CCR基因编码长为369个氨基酸的蛋白,该蛋白二级结构元件以无规则卷曲和α-螺旋为主,属于依赖NAD表异构酶/脱氢酶家族,其辅助因子结合区域和底物结合位点高度保守。[结论]成功从象草中克隆出肉桂酰辅酶A还原酶基因。它具有CCR同源基因典型的特征。获得的各种生物信息学数据为今后开展此酶的深入研究以及对象草的更好利用提供了一定的理论参考价值。     

肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的底物制备及酶学特性研究

采用原核表达体系和HPLC法,分别获得肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)及其反应底物———香豆酰CoA酯,并对CCR酶学特性进行研究分析。结果表明,通过酶学方法和HPLC的分离纯化能够得到较高浓度和纯度的CCR反应底物;重组毛白杨CCR的最适反应温度是37℃,最适pH值为6.25,Km值为5.664μmol/L,Vmax为4.09 nmol/Ls。     

茶树‘紫娟’肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR）克隆及序列分析

通过克隆茶树肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)的cDNA序列,为研究其蛋白结构和功能奠定基础。对利用cDNA-AFLP技术获得的‘紫娟’茶树成熟叶片上调的差异表达片段TDF,设计特异引物,利用RACE末端扩增技术,分别扩增出5′端和3′端目的片段,测序后进行拼接获得茶树肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)cDNA全长序列,并进行序列分析。结果表明:克隆的茶树CsCCR基因cDNA全长1 259bp(GenBank登录号为KJ995737),其中开放阅读框957bp。同源比对发现,与蓖麻、丹参、草莓、番茄的CCR蛋白同源性分别为67%、68%、69%和70%。     

苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因原核表达及其结构分析

为了研究苎麻木质素合成关键酶——咖啡酰辅酶A-甲基转移酶(CCoAOMT)基因编码的酶蛋白,了解其结构特点;采用原核表达系统——大肠杆菌表达系统pQE,对苎麻CCoAOMT cDNA编码区进行了高效表达,获得了分子量为29.4kD的苎麻CCoAOMT融合蛋白。采用SwissModel服务器模拟构建了该酶蛋白的空间结构。并利用InsightII软件包中的Docking模块构建了该酶蛋白与辅酶Sinapoyl、SAH和Ca2 相互作用的复合物的结合模型,并利用Discover模块对模拟的结构进行结构优化。可以推知所克隆的苎麻CCoAOMT cDNA编码了咖啡酰辅酶A甲基转移酶,具有O-甲基转移酶蛋白典型的催化功能,参与苎麻木质素单体前体的甲基化反应。     

云南马铃薯A病毒分布及其外壳蛋白分子变异分析

为研究云南马铃薯A病毒(PVA)分布及其外壳蛋白的分子变异,2007年至2011年分别从云南滇西北、滇东北、滇中及滇南马铃薯种植区采集381份马铃薯样品,进行马铃薯A病毒DAS-ELISA检测,结果表明,PVA阳性样品共43份,其中滇西北22份,滇中17份,滇东北4份,滇南未检出。对带有PVA的部分样品进行电镜负染色观察,电镜下观察到长约750 nm、直径约15 nm的线状粒子。根据已报道的PVA外壳蛋白基因(cp基因)序列设计合成特异性引物,以带毒样品总RNA为模板,RT-PCR扩增得到807 bp目的片段,克隆测序并对其推导的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行同源性分析,并比较分析了不同地区PVA分离物CP氨基酸序列分子变异。结果表明,云南不同地区PVA分离物与GenBank中登录的部分PVA分离物CP氨基酸序列同源性为93.3%～100%,依据不同PVA分离物CP氨基酸序列构建系统进化树,云南PVA分离物与中国福建分离物(AF483279)亲缘关系较近,形成一个进化簇。PVA不同分离物CP氨基酸序列分子变异分析表明,不同分离物CP氨基酸变异位点主要分布在氨基酸序列的N端。     

苎麻CCoAOMT基因全长cDNA克隆与序列分析

【目的】试图分离和克隆苎麻内源咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因。【方法】采用RACE技术克隆基因，对序列应用ClustaW 1.82软件进行在线分析，将苎麻mRNA序列、mRNA编码区序列以及氨基酸序列与已报道的其它植物的相应序列进行多重序列排列比较并构建系统树。【结果】获得了苎麻CCoAOMT cDNA全长序列(GenBank注册号：AY651026)；苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶是氧甲基转移酶类；苎麻CCoAOMT基因mRNA序列与已报道的其他植物的相应序列不能聚为一类，其差异明显大于其它植物间的差异。苎麻CCoAOMT基因mRNA编码区序列与玉米（Zea mays：ZMA242980、ZMA242981）的同源性高于其他植物。推导的苎麻CCoAOMT酶蛋白氨基酸序列与杨树（Populus balsamifera：AJ224894、AJ224896）、美洲山杨（Populus tremuloides：PTU27116）的同源性高于其他植物。【结论】苎麻CCoAOMT基因cDNA与其它植物的相应序列具有同源性。     

三角鲂IGF-I基因的分子克隆及其序列分析

 采用RT-PCR技术首次从钱塘江三角鲂肝脏组织克隆了IGF-Ⅰ基因(GenBank No.AY247412)，序列分析表明钱塘江三角鲂IGF-ⅠcDNA序列由486个核苷酸组成，编码包括B、C、A、D和E 5个区域的161个氨基酸，为Ea-2亚型。同源性分析发现，钱塘江三角鲂IGF-ⅠcDNA与团头鲂、草鱼和鲤鱼的同源性分别为99.8%、88.8%和85.8%，钱塘江三角鲂IGF-Ⅰ前蛋白氨基酸序列与团头鲂、草鱼和鲤鱼的同源性分别为99.4%、88.8%和85.4%。在鲤科鱼类中，亲缘性越近鱼种，IGF-Ⅰ及其基因的同源性越高。试验结果为三角鲂种质研究和开发高效生物饲料添加剂提供基础资料。     

江苏山羊品种细胞色素b基因(Cyt b)变异特点及其系统地位分析

测定了江苏山羊品种的细胞色素b基因全序列1 140 bp,并引用10个山羊品种(群体)细胞色素b基因全序列进行比较,分析碱基组成和变异情况以及核苷酸序列差异.以绵羊为外群,分别采用邻近法、最大简约法和最大似然法构建分子系统树,得到的拓扑结构一致,初步提示了江苏山羊品种的系统进化关系:长江三角洲白山羊和黄淮山羊的亲缘关系较近,可能来自同一个母系;它们与日本山羊可能在较早的世代具有共同的祖先.本研究结果也支持将东亚、南亚和东南亚固有山羊群体划分为"东亚"和"南亚"两大亲缘系统的观点.     

不同牛种GH基因外显子5序列变异研究

在测定牛亚科3个牛种(雷琼牛、巴州牦牛和巴州蒙古牛)GH基因外显子5序列的基础上,分析了不同牛种的序列变异特点,同时引用其它牛种(普通牛、瘤牛、牦牛和水牛)的序列构建分子系统树以探讨牛亚科家畜的系统发生关系.结果表明,在雷琼牛、巴州牦牛和巴州蒙古牛中共检测到5个变异位点,核苷酸取代方式仅有转换和颠换,核苷酸平均突变率仅为1.66%,说明这3个牛种GH基因外显子5多态性较为贫乏;5个变异位点中仅有1个为错义突变,导致亮氨酸和缬氨酸的转换,但该突变在牛种中分布有差异.从构建的系统树来看,普通牛与瘤牛先聚为一类,然后再与牦牛聚在一起,最后才与水牛聚在一起,与已有的分类结果大体一致.本研究的结果支持中国南方可能是一支瘤牛发源地的推论,也支持中国牦牛在起源进化历程中可能与瘤牛发生了基因交流的观点.     

番茄斑萎病毒及其与传播介体西花蓟马互作的研究进展

番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是一种世界性危害农业生产的植物病毒,主要通过西花蓟马(Frankliniella occidentalis)以持久增殖型方式进行传播,可对番茄、生菜、辣椒等蔬菜及花卉、烟草等经济作物生产造成严重损失。从番茄斑萎病毒的特征、传播介体、传播途径、病毒与介体互作对番茄斑萎病毒传播的影响等方面进行归纳总结,旨为番茄斑萎病的预防和控制提供参考。     

兔CCR9基因的克隆与序列分析

设计1对克隆引物,从兔十二指肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行序列分析。结果表明：克隆的兔CCR9基因长为624 bp,编码由208个氨基酸残基组成的CCR9前体蛋白,预测CCR9具有多个跨膜区。克隆的兔CCR9基因与绵羊、人的同源性分别为82.9%、82.7%;推导的兔CCR9氨基酸序列与绵羊、人的同源性分别为80.1%、82.2%,其结构特征与绵羊、人的相一致。     

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA 方法对采自中国14个省（直辖市）马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省（直辖市）代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法（Bayesian inference,BI）重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小（约800 bp）的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。     

苹果锈果类病毒在7个品种苹果上的分子变异及系统发育关系

【目的】探究不同品种苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)的分子变异及系统发育关系,为进一步揭示ASSVd分子变异机制打下基础。【方法】以富士、斗南、王林、中秋王、金冠、信侬红和信侬黄7个品种的染病苹果组织为材料,通过特异性引物对ASSVd全基因组序列进行扩增,然后进行分子克隆和序列测定,利用生物学软件DNAMAN对变异序列一致性进行分析并利用生物学软件MEGA构建系统发育树。【结果】共获得210个ASSVd的基因组序列,共计17种变体,大小为325—333 nt。将不同苹果品种获得的17种变体与其他已发表代表性分离物进行分析发现,所有变体被分为3组,组Ⅰ包括10种变体,同已报道的保定富士分离物(KR264032.1)亲缘关系较近;组Ⅱ包括6种变体单独聚类;组Ⅲ包括1种变体,与新疆红富士苹果上的分离物(EU031455.1)亲缘关系较近。进一步根据基因组0—3、221、251、284、302这8个位点的碱基变异,将17种变体分为6种类型:1、nt 0—3(GGTA)+nt 41—46(TAAAAT)+nt 221(T)+nt 251(T)+nt 28...     

水稻条纹病毒云南分离物病害特异性蛋白基因的分子变异

对采自云南大理、陆良、禄劝、石林、玉溪、保山和宜良等地的水稻条纹叶枯病病样,提取病叶总RNA,经RT-PCR、cDNA克隆和序列测定,获得了水稻条纹病毒(Rice strip virus,RSV)7个云南分离物的SP基因序列,核苷酸长为537 nts,并与GenBank中已报道的RSV SP基因进行同源性比较,综合分析了云南RSV不同分离物SP基因的分子变异.对纤细病毒属6种病毒的SP蛋白氨基酸序列进行进化分析,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,与RGSV亲缘关系最远.     

宗地花猪心脏型脂肪酸结合蛋白基因的表达

为有效提高宗地花猪的肉品质,合理评价养殖模式提供理论依据,参照GenBank中猪H-FABP基因序列设计引物,以猪18SRNA为内参基因,应用实时荧光定量PCR方法检测H-FABP基因在不同饲养条件下宗地花猪不同组织器官中的表达量。结果表明:H-FABP基因在肺脏、心脏、肾脏、小肠、脾脏、肝脏、背最长肌、腰大肌中均有表达,但不同饲养条件下其表达水平各异,放养型背最长肌腰大肌肾脏心脏小肠肺脏脾脏肝脏,背最长肌中表达量显著高于其他组织(P0.05);圈养型腰大肌脾脏心脏肺脏小肠肝脏背最长肌肾脏,腰大肌中表达量显著高于其他组织(P0.05),肝脏中表达量高于背最长肌(P0.05)。两种饲养条件下宗地花猪肺脏、肝脏中表达量相当,而在心脏、肾脏、小肠、脾脏、背最长肌中表达差异较大。     

基于PGIP基因的蔷薇科植物分子进化树构建与分析

从NCBI网站筛选到97条蔷薇科植物PGIP基因序列,用邻位相接法构建系统进化树,分析他们之间的亲缘关系。结果表明,蔷薇科植物PGIP基因可聚为17个类群,这与传统的分类结果基本一致,初步探讨了吐根树、耆叶梅、Cercocarpus ledifolius、Purshia tridentate、Horkelia cuueata和卡塔林硬木的亲缘关系,对进一步研究蔷薇科植物之间进化与亲缘关系提供参考。