甘蓝SSR标记在近缘种青花菜的通用性及其应用

本研究对50条甘蓝SSR引物在其近缘种青花菜中的通用性进行了分析,结果表明,38对引物在青花菜上可有效扩增,扩增产物分子量在100～1500bp,有效扩增比率为76%,其中18%具有较好的多态性,揭示了两种作物基因组间存在一定的相似性。同时利用获得的多态性较好的9对引物对青花菜进行基因型鉴定和遗传多样性分析,20份青花菜基因型中共检测到51个基因位点,平均每个引物组合可扩增出5.67个条带,多态性为66.7%。多引物组合可鉴别出所有青花菜基因型。聚类分析结果表明同一来源的基因型间具有相近的遗传基础,且聚类与熟性具有一定的相关性。本研究为今后青花菜种质资源的收集、利用及分子标记辅助育种提供了新的SSR标记和参考。     

利用核心简单重复序列(SSR)标记分析无籽西瓜品种的DNA指纹及遗传多样性

为构建无籽西瓜品种的DNA指纹,实现无籽西瓜品种的快速准确鉴定,客观评价品种的遗传多样性,本研究利用核心SSR标记对我国54份无籽西瓜(Citrullus lanatus)主栽品种进行了分析。结果显示,23对多态性引物共扩增出63种基因型,基因型数2～5个不等,平均2.74个;平均多态性信息量(PIC)为0.39,变化范围为0.04～0.67,有5个品种具有特征谱带;54个品种遗传相似系数变化范围为0.643 9～1.0,平均0.859 3,参试品种具有较高的遗传相似性;组合23对引物,除无法区分雪峰花皮无籽与郑抗无籽1号、郑抗新1号与广西3号、黒宝无籽与桂冠1号,其余品种均能一一区分开,利用PIC0.4的10对引物构建了5份主要参试品种的DNA标准指纹图谱;采用类平均法进行聚类分析,在相似系数0.82处,可将54个品种分为7大类。本研究建立了参试品种的标准DNA指纹图谱,为我国无籽西瓜品种的真实性鉴定和知识产权保护提供了技术基础。     

利用核心简单重复序列(SSR)标记分析西洋梨品种资源遗传多样性

由于梨(Pyrus)本身的自交不亲和特性导致不同地区品种间基因存在较大差异。为鉴定品种资源的多样性,探索重要的遗传特性,本研究利用覆盖梨全基因组17个连锁群中的134个核心简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记对45份西洋梨(Pyrus communis L.)品种资源进行遗传多样性和群体结构分析,对不同来源的SSR标记进行多态性分析。结果表明,来自梨基因组的SSR标记多态性更高,更适合梨的遗传多样性研究;所有SSR引物共检测到673个等位基因,每个SSR位点平均扩增5.02个;45份西洋梨品种的观测等位基因数(observed number of alleles,Na)、有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)、观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)以及Shannon信息指数(Shannon’s information index,I)平均值分别为5.02、3.84、0.73、0.72和1.42;遗传相似系数和聚类分析结果表明,45份西洋梨具有较高的遗传多样性,且品种的演化趋势较均匀,欧洲和美洲的品种没有因地理位置不同而产生太大差异,而是不同来源地的品种相互交织在一起,更加体现了西洋梨之间广泛的基因交流;同时推测未知来源地的库介梨、费莱茵和地里拜瑞可能来源于西欧地区;群体结构分析表明,当K=2时,西洋梨分为Pop1和Pop2两大类群,利布林、波12、拉达那、地里拜瑞、红安久和孔德梨体现了较高的杂合性;不同品种的指纹图谱分析结果表明,至少需要两个以上的引物组合才能够将不同品种区分开。研究结果为全面评价西洋梨的遗传背景和特征、准确鉴定不同品种资源提供了科学依据和高效标记,为今后西洋梨种质资源的保护利用以及遗传育种提供基础资料。     

小麦优异品系遗传构成的简单重复序列(SSR)分析

为了探讨优良品种形成的遗传学基础,本研究利用简单重复序列(SSR)标记分析了近期育成的3个丰产小麦(Triticum aestivum L.)品系(百农金光588、百农AK58-18和百农T5)及其姊妹系(百农0487和百农高光3709)的遗传构成.结果表明,2个杂交组合(周麦18/百农AK58和周麦16/温麦8号//百农160)中亲本对不同姊妹系的遗传贡献率均具有较大差异,其中百农AK58对百农金光588、百农AK58-18和百农0487的遗传贡献率分别为51.2％、57.0％和54.0％,高于亲本周麦18的贡献率;百农160对百农高光3709和百农T5的遗传贡献率分别为41.9％和36.4％,高于另外2个亲本(周麦16和温麦8号)的贡献率.在A、B、D基因组及21对染色体上,衍生后代对不同亲本遗传物质的继承率也表现丰富的多样性.百农金光588、百农AK58-18和百农T5分别具有109、36和55个不同于其他姊妹系的SSR特异位点,分别形成了11、3和3个特异染色体区段.这些基因组区段上存在许多与产量和抗病等重要农艺性状相关的基因和QTL,对提高小麦丰产性可能起了重要作用.     

利用简单重复序列(SSR)标记分析太湖稻区现代粳稻品种的遗传多样性

太湖地区有丰富的粳稻(Oryza satiua ssp.japonica)种植资源,随着品种大面积推广应用,育种材料的遗传基础趋窄,相似性增高,使粳稻育种突破困难。本研究利用分布于水稻(Oryza satiua L.)12条染色体上的24对简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)引物对太湖地区的42份粳稻品种进行遗传多样性分析。结果表明,有23对SSR引物在42份粳稻材料间表现出多态性;23对引物共检测到105个等位基因,每对SSR引物检测到等位基因为2~8个,平均为4.57个,有效等位基因共有56.43个,平均每个位点为2.45个。每个多态位点的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)变幅为0.083 0~0.8079,平均为0.496 6;每个粳稻材料多态性位点数的变幅为6~19,等位基因总数的变幅为27~55;42份粳稻品种间的遗传相似系数变幅为0.391~0.990,平均为0.610,遗传相似系数在0.50~0.80之间的材料占全部的74.45%,供试材料相似度高;非加权配对算术平均法(unweighed pair group method with arithmetic mean;UPGMA)聚类结果显示,遗传相似系数为0.50,42份粳稻材料可以分为两个类群,一个类群包含19份常规粳稻,另一个类群包括其他23份杂交粳稻。结果显示,太湖地区的粳稻品种总体上遗传背景相似度高,遗传多样性不够丰富,育种工作有待进一步加强新的基因资源引进和利用,创新水稻育种材料。本研究结果为新品种选育提供技术支持和理论根据。     

大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。     

玉米自交系产量和品质相关性状与简单重复序列(SSR)的关联分析

为寻找并确定控制玉米产量、品质的基因组区域,本研究利用64对核心SSR(simple sequence repeats)标记对257份玉米(Zea maysL.)自交系构成的群体进行基因分型,分析群体连锁不平衡位点、群体结构,在此基础上,采用TASSEL软件的GLM(general linear mode)程序对株高、穗位、生育期、穗长、穗行数、百粒重、脂肪含量、蛋白质含量和淀粉含量共9个性状的表型数据与标记进行回归分析,确定标记对表型的解释率。结果表明:(1)在公共图谱上的SSR位点组合都有一定程度连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD),P<0.01时,LD成对位点占总位点组合20.29%,D’>0.5成对位点比例为12.65%。(2)SSR数据遗传结构分析表明,群体可分为5个亚群。(3)共鉴定出26个标记位点与9个性状相关联,大多集中在4、6、7和10染色体上,其中第7染色体上标记最多,为5个。8个位点的变异分别与株高、穗位、生育期、穗长、穗行数和蛋白质含量等6个表型性状极显著相关(P<0.01),分别为umc1294作用于株高,对表型的解释率为7.2%;umc1741及phi116作用于穗位,对表型的解释率为11.37%和8.57%;phi328175及phi260485作用于生育期,对表型的解释率为4.74%和5.6%;umc1741作用于穗长,对表型的解释率为5.77%;umc1309作用于穗行数,对表型的解释率为6.68%;bnlg1450及bnlg1185作用于蛋白质含量,对表型的解释率为9.41%和9.81%;其他18个标记与9个性状显著相关(P<0.05)。与单个性状关联的标记数目为1～7个,解释率为4.74%～14.31%。与产量相关性状关联的位点(次)累计为30个,与品质相关性状关联的位点(次)累计为7个,位点数目上品质性状远少于产量性状。部分标记与多个性状关联,可能是性状相关或一因多效的遗传基础,一些标记同时与某性状关联,多数标记与定位于遗传图谱的QTL(quantitative trait loci)一致,也有互补性。研究结果表明,这些位点及其区域内存在很多与产量、品质等性状相关的QTL,对提高玉米产量、改善玉米品质可能起到重要作用。     

大白菜硫代葡萄糖甙合成基因SSR标记的开发

硫代葡萄糖甙(glucosinolates,GS)是一种含氮、硫的重要植物次生代谢产物,是十字花科蔬菜风味的主要来源。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)基因组序列信息,比对GS生物合成相关基因的序列信息,发现大白菜中与GS含量相关的候选基因102个,分布于10条染色体上。拟南芥GS合成基因在大白菜中的同源基因个数分别为:零拷贝基因8个、单拷贝基因13个、2拷贝基因17个、2个以上多拷贝基因14个。通过FASTPCR6.0软件分析目标基因上下游序列各5kb,共开发出237个简单重复序列(SSR)位点,16个基因没有发现SSR位点,72个基因存在1~4个SSR位点,5个基因存在5个SSR位点,4个基因存在6个SSR位点,4个基因存在7个SSR位点,1个基因存在8个SSR位点。所开发的SSR位点中,共发现4种重复类型:单核苷酸重复最多,共122个,占SSR总数的51.4%;其次是二核苷酸重复类型,共48个,占SSR总数的20.3%;三核苷酸重复类型最少,共7个,占SSR总数的3.0%,另外60个SSR无明显的重复类型。具有SSR位点的86个基因中,77个基因可以设计SSR特异引物,其中49对特异引物在供试的75份大白菜高代自交系中得到有效扩增。其中16对引物具有多态性,占全部引物的20.8%;18对引物无多态性,占全部引物的23.4%;15对引物杂带多,占全部引物的19.5%;另外28对引物无扩增产物,占全部引物的36.4%。最终11对获得了清晰多态性扩增产物,共检测出26个等位基因。本研究为分子标记辅助选择培育高有益GS成分的大白菜新品种提供了基础资料,进而加快大白菜营养品质育种的进程。     

基于石蒜属转录组序列的SSR分子标记开发应用

为开发石蒜属简单重复序列(SSR)分子标记,并研究SSR引物在石蒜属内的通用性,本研究对石蒜属石蒜、忽地笑、中国石蒜、长筒石蒜、换锦花、香石蒜6个种质转录组测序,检测SSR位点并设计引物,通过PCR扩增和毛细管电泳判断引物的有效性和多态性,绘制石蒜属17个种质资源的指纹图谱并对杂交后代的真实性进行早期检测。结果表明,共获得404 481条Unigenes,利用数据库进行同源比对和功能注释,并对Unigene进行SSR位点挖掘和分析,共检测到59 612个SSR位点。其中,单核苷酸重复>二核苷酸重复>三核苷酸重复,分别占SSR总数的62.88%、20.06%和14.66%,四核苷酸及以上重复单元相对较少。选取并合成8对荧光引物进行PCR扩增,通过毛细管电泳检测发现,8对荧光引物共检测到60个多态位点,多态位点数平均为7.50,多态性信息含量(PIC)值变化范围为0.148 0~0.940 8,平均值为0.593 0。利用引物扩增带型组合法构建了石蒜属17个种资源的指纹图谱,其中引物QZ209可区分所有供试材料,并可用于杂交后代鉴定。本研究开发的SSR标记具有丰富的多态性,在石蒜属植物的资源多样性分析、杂交种鉴定及遗传图谱的构建应用中具有重要意义。     

菠菜转录组SSR位点分析及其分子标记的开发

简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)分子标记具有多态性高、重复性好、共显性等特点,己广泛用于蔬菜作物遗传育种研究中.本研究利用MISA软件对菠菜(Spinacia oleracea)转录组SSR位点信息进行分析,开发适用于菠菜的SSR分子标记,并对不同菠菜材料的遗传多样性进行分析.结果显示,在获得的44 796条基因簇(Unigene)中检测出2 045个SSR位点,检测出2 045个SSR位点,分布在1 940条Unigene上,发生频率为4.33％,平均距离为19.81 kb.菠菜SSR中以单、三、四核苷酸重复为主,分别占总SSR的19％、65％和7％,重复长度主要为18～24 bp,占菠菜总SSR的93.55％,以重复次数6次和7次为主,分别占菠菜总SSR的31.42％和31.05％.菠菜转录组中单核苷酸重复类型为A/T,二核苷酸重复主要为GA/TC和AG/CT,三核苷酸重复主要以CAA/TTG、GTT/AAC、GAA/TTC、TGT/ACA和GAT/ATC为主.本研究共设计了2 199对SSR特异位点引物,随机挑选218对引物对9个不同类型的菠菜材料进行扩增检测,其中38对表现出多态性.利用UPGMA做图进行聚类分析,9份菠菜材料聚为3类.本研究通过对菠菜转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发,获得了多态性较为丰富的SSR位点,为菠菜遗传多样性的分析、遗传图谱的构建及分子标记辅助育种提供了基础资料.     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

结球白菜结球前期基因表达序列标签（EST）分析

以结球白菜(Brassica rapa L.ssp．pekinensis)结球前期心叶为材料，构建了结球前期球叶cDNA文库，随机挑选克隆单向单次测序后，共得到1162条峰图良好和插入片段长度大于150bp的可用序列。BLASTX及BLASTN序列比对分析表明，94．8％(1102／1162)的表达序列标签(EST)可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源类似物。同源性最大的蛋白质按物种来源分析后发现，大约77％的功能已知蛋白质来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，另外还有60个EST与已发表的植物基因没有同源性，这一部分EST对于研究结球白菜独特的生理和形态发育途径以及开展基因组分子作图具有重要的意义。同源蛋白质按其功能进行分类表明，参与蛋白质合成过程的酶或蛋白质的EST数量最多，其次是参与能量代谢过程(包括光合作用)的EST序列。在核苷酸水平上，全部EST中只有51％的同源物来自拟南芥。对上述1162条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)共获得895个非冗余片段重叠群，其中723个仅由一个EST组成(即singletons)，表明结球白菜结球过程中表达的基因种类繁多。大量EST的获得为进一步了解结球白菜结球机制及获取相关基因提供了重要的序列信息。     

菜苔小孢子培养及再生植株的倍性鉴定*

以早熟菜苔(Brassica rapa ssp．parachinensis)品种油青四九为供体材料，研究了更新培养液和秋水仙碱分别直接处理分离的菜苔小孢子对胚发生频率的影响。分离小孢子先用NLN-17培养液32℃热激培养2d，换成NLN-10培养液后在24℃继续培养，比不换培养液直接用NLN-10培养液处理的胚状体产量明显提高，更新培养液并能改善胚状体质量。用秋水仙碱0．8mg／L直接处理分离小孢子能明显增加胚状体产量，秋水仙碱浓度过高不利出胚和胚状体萌发。流式细胞仪(FCM)鉴定菜苔小孢子再生植株的染色体倍性表明，有较高的自发二倍体率(70％)和四倍体率(8％)，而其它多倍体和混倍体比率相对较少。     

大白菜抽薹相关基因BrFLC1的KASP标记开发

为了提高大白菜耐抽薹品种的分子育种效率,本研究针对大白菜抽薹相关基因BrFLC1第6个内含子的第一个碱基(Pi6+1)G-A的SNP变异开发进行高通量检测的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。结果表明,开发的KASP标记BrFLC1-KASP1可有效将晚抽薹类型材料Y177-12(G)和早抽薹类型材料Y195-93(A)分为2组。利用BrFLC1-KASP1标记可以对57份大白菜材料的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与酶切扩增多态性标记(CAPS)G-MvaI以及直接测序法的鉴定结果完全一致。综上所述, BrFLC1-KASP1标记在大白菜材料中具有通用性,且具有准确率高、成本低、效率高的特点。本研究结果对大白菜耐抽薹性的分子标记辅助选择具有重要的育种实践价值。     

江西野生毛花猕猴桃群体SSR遗传多样性研究

为分析江西野生毛花猕猴桃群体遗传多样性,以江西省境内的5个野生毛花猕猴桃雄性群体(72个个体)为试验材料,采用SSR分子标记技术,选取15对多态性引物,利用聚丙烯酰胺电泳对PCR产物进行检测。结果表明,15对SSR引物共检测到86个位点,多态性位点百分率为100.0%;观察到的平均等位基因数为5.733,有效等位基因数为3.002,Shannon信息指数为1.046。表观杂合度介于0.111~0.819之间,预期杂合度介于0.041~0.876之间,遗传分化系数为2.01,野生毛花猕猴桃雄性群体间存在较大的遗传分化。5个毛花猕猴桃雄性群体遗传距离范围为0.102~0.409,遗传相似度范围为0.665~0.903,群体间遗传距离与地理距离无相关性。群体的遗传多样性丰富度依次为庐山>井冈山>南源山>武功山>麻姑山,江西地区供试的野生毛花猕猴桃雄性群体在分子水平上具有丰富的多态性。本研究结果为毛花猕猴桃雄性品种选育、种质创新与利用提供了一定的理论基础。