玉米新月弯孢叶斑病研究进展

 玉米弯孢叶斑病是一种世界性玉米病害,也是中国玉米产区的主要病害之一。20多年来,国内外在该病害发生规律、致病性分化与诱导抗性机理、生物防治技术等方面开展了深入研究。本文主要就该病害优势致病菌新月弯孢菌 [Curvularia lunata (Wakker)Boedijn]的生物学特性、致病因子与生理分化机理、毒素结构鉴定、毒素合成与调控、诱导抗病性分子机理等方面的研究进展进行综述,以期对玉米弯孢叶斑病防控技术的创新提供参考。     

玉米新月弯孢叶斑病研究进展

 玉米弯孢叶斑病是一种世界性玉米病害,也是中国玉米产区的主要病害之一。20多年来,国内外在该病害发生规律、致病性分化与诱导抗性机理、生物防治技术等方面开展了深入研究。本文主要就该病害优势致病菌新月弯孢菌 [Curvularia lunata (Wakker)Boedijn]的生物学特性、致病因子与生理分化机理、毒素结构鉴定、毒素合成与调控、诱导抗病性分子机理等方面的研究进展进行综述,以期对玉米弯孢叶斑病防控技术的创新提供参考。     

玉米新月弯孢菌(Curvularia lunata)的RAPD分析

 对分离自玉米弯孢菌叶斑病标样中的77株新月弯孢菌和1株来自水稻的新月弯孢菌进行RAPD分析表明,菌株间具有丰富的遗传多样性,在相似系数约0.60处,所有菌株被聚为3个组,但88.0%的菌株聚入第Ⅰ组内,其余菌株被聚入另外2个组内。第Ⅰ组内共有69个菌株,包含来自不同区域的致病性较强的菌株,是玉米弯孢菌叶斑病的优势类群,其余2个类群主要是一些致病能力较弱或不致病的菌株。结果表明,新月弯孢菌种内菌株的遗传多样性与致病性相关,但与菌株地理来源无明显的直接关系。     

新月弯孢菌及其近似菌菌落形态和可溶性蛋白电泳图谱比较分析

通过对分离自玉米及其他寄主的 12个新月弯孢菌菌株和 5个近似菌株菌落形态及可溶性蛋白电泳谱比较分析 ,表明菌落形态在不同种之间存在明显的差异 ,同种之间也存在一定差异 ,但不稳定和存在变异。 17个菌株可溶性蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示 ,Curvularia属在Rf值为 0.177处有一条该属的特征蛋白带 ,新月弯孢菌在Rf值为0.225处有一条该种的特征蛋白带 ,但新月弯孢菌蛋白带存在多样性 ,聚类分析将未能确定的 13号菌株定为不等弯孢菌     

稗草生防菌新月弯孢菌株J15（2）的生物学特性

研究了分离自稗草上的一个致病菌新月弯孢Curvularia lunata菌株J15（2）的基本生物学特性。结果表明,该菌菌丝生长、产孢的最适温度为28～32℃,pH为6～8。菌丝生长对光照无要求,黑暗利于增加产孢量,培养至15d可达产孢高峰。碳、氮、磷和硫等元素是该菌菌丝体生长、产孢的必需元素,钾、镁和铁对菌丝体的生长、产孢有极大的促进作用。分生孢子萌发的适宜温度范围为20～35℃,最适温度28℃;适宜培养基初始pH值在4～10之间。在58℃下,分生孢子10min失活。     

新月弯孢菌营养体亲和群鉴定方法探讨

 采用菌株直接配对、显微镜观察菌丝融合和硝酸盐缺陷型(nit)突变体互补测试法,对44个来自不同地区的玉米弯孢菌叶斑病叶中的新月弯孢菌(Curvularia lunata)菌株进行了营养体亲和性分析。在野生型菌株的两两配对中,C.lunata菌株接触产生4种反应类型,但无明显的抗衡反应产生。在菌丝融合显微观察中,光学显微镜下只见大多数菌丝反应为一菌丝向另一菌丝无限靠近,未见融合,但在电子显微镜下,发现两菌丝细胞已不再是独立的。这些结果表明,因两菌落间的抗衡反应和菌丝融合特征都不明显,故不宜采用直接配对和显微观察来划分C.lunata的营养体亲和群。在nit突变体互补测试中,菌株在KClO₃浓度1.5%~3.0%的KPS中诱导表明,2.0%~3.0% KClO₃适宜于大多数菌株。抗氯酸盐突变体在Czapek培养基中能鉴定出nit突变体,但在MM上却不能。全部3640抗氯酸盐突变体在Czapek中共鉴定出2 40个稳定的nit突变体,其中nit1占59.2%,nit3占39.2%,NitM占0.8%,nit D (3种氮源都不能利用)占0.8%。44个菌株中,24个(55%)获得了nit突变体,20个(45%)还没有,仅2个菌株(124和155)各获得了1个NitM突变体。各菌株突变体类型间只有NitM与nit1或nit3是异核亲和的,其余均不能产生亲和反应。菌株124和155都是营养体自身亲和菌株。用2个NitM作测试菌株,初步划分出2个VCGs,5个归入VCG1,另有5个归入VCG2,其它菌株因未获得NitM或nit突变体还不能鉴定。以上结果表明,硝酸盐缺陷型突变体互补测试法可用于鉴定C.lunata菌株的营养体亲和群。     

马唐草新月弯孢生物学特性及其代谢产物活性测定

对马唐草新月弯孢霉Curvularia lunata（Wakker）Boedijn菌株MT-011的生物学特性测定结果表明：该菌株致病性强,菌丝体生长最适温度30℃,致死温度65℃/10min,最适pH值7,碳源以D-果糖最佳,氮源以硝酸钠最佳。产生分生孢子最适温度为30℃,最适pH值9,碳源以蔗糖产孢量最大,氮源以赖氨酸产孢量最高。分生孢子萌发温度在20～40℃之间没有差异,萌发率均达90%以上;最适pH值7;光暗交替为最佳光照条件。除赖氨酸外所有供试碳源和氮源的孢子萌发率都很高,处理之间没有差异。MT-011菌株产生的活性物质作用于马唐草,可使叶片黄化或枯死脱落,与用菌体接种时造成大量叶片黄化或枯萎的症状极为相似。代谢产物对指示植物柱花草、辣椒和玉米的种子发芽后的根茎生长都有明显的抑制作用,抑制率达83.27%,表现出很好除草活性。     

新月弯孢变种的生物学特性及其对药剂的敏感性

为明确新月弯孢变种的发生和流行规律及有效防治方法,在不同碳源、氮源、温度、pH、光照等培养条件下,测定新月弯孢变种菌株HNWB-131、HNWB-185和模式菌株CX-3的生物学特性,并采用菌丝生长速率法测定这3株菌株对5种药剂的敏感性。结果表明,新月弯孢变种菌株HNWB-131和HNWB-185对碳、氮源的利用更敏感,在大部分碳、氮源培养基上其菌丝均为灰白色至黑色,与新月弯孢模式菌株的墨绿色存在明显区别;2株新月弯孢变种菌株的菌丝生长和产孢最适温度均为30℃,而新月弯孢模式菌株的菌丝生长和产孢最适温度分别为30℃和35℃;新月弯孢变种对光照条件更敏感,且黑暗条件对其分生孢子的产生和萌发有一定刺激作用;新月弯孢变种菌丝生长的最适pH为7~9,比新月弯孢模式菌株的最适pH范围窄（pH为5~11）。苯醚甲环唑对CX-3、HNWB-131、HNWB-185菌株的菌丝生长抑制作用最好,EC₅₀分别为0.39、0.58和0.52 μg/mL;其次为丙环唑,EC₅₀分别为0.79、1.97和1.64 μg/mL,表明2种新月弯孢变种对药剂的敏感性比模式菌株差。     

玉米弯孢叶斑病菌生理分化及鉴定技术

 从我国20余个主栽玉米品种和20个骨干自交系中筛选出沈135、78599-1、Mo17、477、C8605、E28、7922和黄早4等8个自交系,作为鉴别寄主来研究弯孢叶斑病菌的生理分化。研究表明,弯孢叶斑病菌[Curvularia lunata(Wakker) Boed.]在温室进行的苗期鉴定与田间成株期鉴定的生理分化结果一致。苗期鉴定具有操作简单、鉴定环境条件易控制等特点。通过8个鉴别寄主将采自我国玉米产区的20株弯孢叶斑病菌分为6个致病类型,其中类型A致病性强、分布广,为优势致病类群;类型D主要分布在我国零星发生的地区,为弱致病类群。同时研究了影响病菌生理分化鉴定的主要环境因子,其中湿度、温度和植株营养状况对病菌生理分化鉴定结果有明显影响。本研究结果为我国玉米品种抗性鉴定、弯孢菌叶斑病流行监测和品种合理布局提供了理论依据。     

芦荟苦素和芦荟凝胶对新月弯孢的抑菌活性

通过研究芦荟苦素和芦荟凝胶对新月弯孢Curvularia lunata的抑菌效果,以期寻找天然活性物质用于水稻新月弯孢叶斑病的防治。滤纸法显示:300 mg/mL的芦荟苦素处理28 h后对新月弯孢可产生明显的抑制带(3.37 mm);在孢子液(3 × 104 cfu/mL)平板上可产生直径为51.27 mm的抑菌圈,且抑制效应可达6 d。用1、2、4、8、16、32、64 mg/mL系列质量浓度的芦荟凝胶处理新月弯孢5 d时的菌丝抑制率范围为9.25% ~ 56.21%,抑菌率随芦荟凝胶质量浓度的增加而升高。此外,从处理后2 d到5 d,64 mg/mL芦荟凝胶的抑制率增加了21.87%。显微镜检表明,160 mg/mL芦荟苦素处理的C. lunata菌丝生长弱于对照,且无附着胞产生。经芦荟凝胶处理后,分生孢子芽管的生长速度显著低于对照,其生长抑制率可达75.39%-96.58%。本研究首次报道芦荟苦素能有效抑制C. lunata的菌丝生长和分生孢子萌发,而芦荟凝胶能有效抑制C. lunata的菌丝和芽管生长。     

玉米弯孢叶斑病菌致病类型分化研究

 利用鉴别寄主和同工酶技术,对采自黑龙江、吉林、辽宁和河北4省玉米弯孢叶斑病菌菌株的致病类型进行分析。研究表明,鉴别寄主技术将26个菌株的致病类型划分为4种类型,其中强和中等致病类型主要分布在辽宁省瓦房店市、吉林省公主岭市和河北省保定市。玉米弯孢叶斑病菌在酯酶、苹果酸脱氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶同工酶谱存在差异,不同菌株间的某些同工酶谱带数差异显著。     

玉米弯孢叶斑病菌酵母双杂交cDNA 文库的构建及评价

 BD SMART technique and LD-PCR were applied to synthesize double strand cDNA(ds cDNA).The ds cDNA and pGADT7-Rec were transfered into competent yeast cell to construct yeast two-hybrid cDNA library of Curvularia lunata by homologous recombination method. The results showed that library capacitance was 2. 46 × 105 and transformation rate was 2. 13 × 105 / μg pGADT7-Rec. The plaque titer of the library was 2. 5 × 108 pfu / mL and the recombination frequency was 88. 24% . The length of inserted cDNA fragment was ranged from 0. 4 kb to 3 kb in average. This is the first time to use BD SMART technique to construct yeast two-hybrid cDNA library of C. lunata by homologous recombination.     

玉米弯孢叶斑病菌毒素稳定性的研究

玉米弯孢叶斑病菌在Fries培养基上培养20 d左右,菌丝大量生长并紧密交织成团时病原菌即可产生大量毒素。毒素粗提液经高温处理仍具有生物活性,甚至略有增强。该毒素经低温处理后,可保存30 d以上而不失活。经验证毒素原液中的活性成分经光处理10 h不失活,对光具有良好的稳定性。     

酶联免疫技术检测玉米弯孢菌叶斑病的研究

本文通过提取玉米弯孢菌叶斑病病原菌蛋白质，免疫家兔制备抗血清，用不等弯孢菌、玉米小斑病菌，玉米圆斑病菌和玉米大斑病菌（与弯孢菌相似或相近）蛋白吸附除去抗血清中的交叉反应抗体，提高了抗体的特异性，建立了酶联免疫检测玉米弯孢菌叶斑病的技术，应用ABC-ELISA和间接ELISA检测玉米弯孢菌叶斑病，比较了两种方法的灵敏性和特异性。结果显示ABC-ELISA较间接ELISA检测灵敏度高2到5倍。     

玉米弯孢叶斑病菌Clm1 基因的克隆及其功能验证

 从玉米弯孢叶斑病菌中克隆到MAPK 基因之一的Clm1,其与玉米小斑病菌中的ChMps1 基因同源。采用InversePCR 和RACE 技术获得了该基因的全序列及其所在区域的旁侧序列。该基因cDNA 全长1. 251 kb,编码416 个氨基酸。通过农杆菌介导的转化方法对其进行了敲除。Clm1 敲除突变体在细胞壁完整性,分生孢子产量及形态方面发生明显变化,其侵染离体叶片的能力明显下降,纤维素酶活性有所下降,说明该基因与弯孢叶斑病菌细胞壁完整性及致病性有着密切的联系。     

PEG介导的玉米弯孢叶斑病菌遗传转化

为了探索不同酶系组成对玉米弯孢叶斑病菌原生质体制备的影响,建立该病菌原生质体遗传转化系统,采用酶系混合物裂解菌丝体制备原生质体,采用PEG介导方法进行原生质遗传转化,通过PCR和Southern blotting技术对转化子进行验证。结果表明:1%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶混合酶系为玉米弯孢叶斑病菌原生质体制备的最佳酶系,可以产生原生质体6.78×106 cfu/mL。用PEG介导方法转化共获得16个稳定的转化子,从中随机挑取5个转化子发现质粒pV2已被成功整合到基因组中。本研究获得了制备玉米弯孢叶斑病菌原生质体的最佳酶系,建立了PEG介导的原生质体遗传转化体系,为开展该菌致病相关基因克隆和基因功能研究提供了一种手段。     

外源化学物质对玉米抗弯孢菌叶斑病的诱导作用

测定了9种外源化学物质对玉米抗弯孢菌叶斑病的诱导作用,它们的诱导效果为9.8%～49.6%。其中,水杨酸的诱导效果最好为49.6%,核黄素、草酸、维生素K3和磷酸氢二钾也表现出较强的诱导能力,诱导效果分别为38.8%、41.5%、27.2%、37.8%;比较了玉米品种间和不同生育期的诱导效果,品种间的诱导效果有一定的差异,但差异不显著。不同玉米生育期的诱导效果以苗期最好,拔节期其次,最差的是成株期。对两种化学物质组合使用研究发现,有些具有协同作用,有些则有抑制作用。     

突脐蠕孢与弯孢原生质的双亲灭活融合

采用灭活原生质体方法,对致病力强、产孢量低的突脐蠕孢EM菌株和致病力较弱、但产孢量高的弯孢CL菌株两株稗草致病菌进行原生质体融合,通过观察形态、生物学及抑草活性等特性筛选融合子。结果表明,2%溶壁酶+2%蜗牛酶处理获得两亲株的原生质体释放数量最高,CL和EM分别达1.25×106个/ml和1.21×106个/ml;再生培养基○c处理的CL和EM原生质体再生率分别达14.7%和13.2%。EM利用热灭活55℃5min;CL利用紫外灭活30s,距离20cm,照射时间4min;聚乙二醇促融,获得3个融合子。融合子在孢子形态上与亲株存在明显差异,其菌丝生长速度、孢子产量、对稗草根生长的抑制作用等也与双亲菌株有差异。