禽流感(H9N2亚型)酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立

采用AIV灭活油乳苗（H9N2）对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清，取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法，经过Sephadex G25层析柱提纯后可获得纯度很好的IgG。将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶（HRP），制备禽流感酶标抗体（IgG—HRP），利用所提取的AI—IgG和所制备的禽流感酶标抗体按照双抗夹心Dot—ELISA试验操作步骤，采用方阵法分别摸索包被抗原及酶标抗体的最佳浓度，以及各步反应时间等最佳反应条件，以建立一种优化的AIV双抗夹心Dot—ELISA检测法。结果表明，所制备的AI高免血清HI效价为10log2；AI酶标抗体克分子比值为2．45；优化的Dot—ELISA各条件为：包被AI—IgG最佳稀释倍数为1：50；最佳封闭剂为1％牛血清白蛋白；AI酶标抗体最佳稀释倍数为1：100；待检抗原与2种抗体的感作时间均为0．5h（37℃）。优化后的检测方法可在2．5h内诊断结果。制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果。而且敏感性提高了3倍，与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。     

猪血清中抗猪丹毒丝菌特异性IgG的纯化

为了获得纯度高、特异性好的抗猪丹毒丝菌特异性IgG，采用抗原反向吸附结合重组葡萄球菌蛋白A(SPA)亲和层析法对猪丹毒丝菌阳性血清进行纯化。结果表明，血清用量对IgG的纯化结果影响不大，而细菌的用量则与IgG的获得量成正比；用猪丹毒丝菌与阳性血清吸附，初步纯化出的猪丹毒丝菌特异性IgG，再用SPA亲和层析法特异性的浓缩和纯化IgG，获得的抗体含量为240 μg/mL，即从8 mL阳性血清中获得360 μg猪丹毒丝菌特异性IgG，其纯度接近100%，可用于噬菌体展示的靶分子。 关　键　词：猪丹毒丝毒；特异性免疫球蛋白G(IgG)；猪血清；IgG纯化；纯度；重组葡萄球菌蛋白A凝胶(SPA)；SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)     

白斑综合征病毒单克隆抗体的制备及BA-ELISA方法的建立

白斑综合征病毒(white spot syndrom virus,WSSV)是甲壳类动物的重要病原,作者采用提纯的WSSV免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,共得到3株能特异分泌抗WSSV的单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞(1E9、1E10、4F5)。将3株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1∶104~105。1E9、4F5的抗体亚型均为IgG1,1E10的抗体亚型为IgG2b。特异性实验表明:3株单抗与虾类病原桃拉综合征病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、哈维氏弧菌(V.harveyi)均无交叉反应。Western bolt分析表明:单抗1E9与病毒28kD外膜蛋白特异性结合。采用生物素标记纯化后的单抗1E9,并建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(Biotin-Adivin ELISA,BA-ELISA)用于WSSV的检测,该方法对提纯病毒的检测灵敏度约为4 ng,对病虾血淋巴的检测灵敏度达1∶25000。     

犬血清IgG的纯化、抗体制备及其鉴定

[目的]探讨犬血清IgG的纯化方法。[方法]采用硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析提取纯化犬血清IgG,利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法鉴定所得产品的纯度和免疫活性。[结果]获得的纯化犬血清IgG的SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的犬血清IgG;重链分子量为58kD,轻链分子量为27kD,IgG分子量为170kD。特异性检测发现犬血清IgG重链和轻链都能与鼠抗犬血清IgG抗体结合,表明纯化犬血清IgG具有免疫原性和反应原性。[结论]硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析可获得纯度高、活性好的纯化犬血清IgG,为犬血清IgG相关的免疫学试验提供了高质量的免疫材料。     

金银染色三抗体夹心法检测兔出血病病毒（RHDV）抗原

成功地建立了检测兔出血症病毒（RHDV）抗原的金银染色（SECGA）三抗体夹心法，并确定了试验流程中鼠抗RHDV－IgG(1:10)、兔抗RHDV－IgG（1：160）、金标羊抗兔IgG(1:50）等三项的最佳工作浓度及最适显影时间（20min）。实验结果表明，本法除了具有Dot-ELISA的高度特异性外，还具有抗原量少、敏感性高、不参与3，3－二氨基联苯胺盐酸直国等有害物质、实验结果更可靠等优点，适合于现场推广应用，并为兔出血症的诊断提供可靠的实验手段。     

Zmu-1:DHP豚鼠免疫学功能研究

采用ELISA法和流式细胞法，测定经卵白蛋白（OVA）免疫豚鼠的球蛋白Ig和T淋巴细胞增殖率的变化规律，研究Zmu-1：DHP豚鼠对病毒易感性的免疫学基础。结果表明：①豚鼠最佳OVA免疫剂量为0．1ms／只；②OVA刺激后，Zmu-1：DHP豚鼠产生的特异性IgG及其亚类抗体，与DHP豚鼠基本相同；③Zmu-1：DHP豚鼠经OVA刺激，T淋巴细胞的增殖率显著低于DHP豚鼠；④OVA刺激豚鼠很少产生IgE；⑤加与不加Al（OH）3免疫比较，IgG1含量变化较大。表明Zmu-1：DHP豚鼠的细胞免疫功能较低，体液免疫功能与其他豚鼠相同，初步认为T细胞免疫功能低下，可能是引起Zmu-1：DHP豚鼠对某些病毒较敏感的原因之一。豚鼠的变态性抗体IgE产量较小；Zmu-1：DHP豚鼠适合于制作感染模型、研究免疫学机制或免疫功能的动物模型。     

比较免疫磁珠法与A蛋白亲和层析法纯化兔抗血清中的IgG

优化了免疫磁珠分离法纯化抗血清的实验条件,并与A蛋白亲和层析法比较纯化效果,以求得到一种简便、快速、高效的纯化IgG方法.结果表明：从5只新西兰兔获得210 mL试管凝集效价高达1∶5 120的兔抗鳗弧菌抗血清,磁珠与IgG结合10 min达到平衡,其最大结合量为0.227 mg/mL;免疫磁珠分离法与A蛋白亲和层析法得到的IgG纯度都很高,经过SDS-PAGE电泳都只得到25 ku和55 ku左右的两条带;免疫磁珠分离法得到的抗体ELISA效价高于A蛋白亲和层析法;免疫磁珠分离法反应所需时间（10 min）小于A蛋白亲和层析法所需的20 min,其得率（11.5 mg/mL）也高于A蛋白亲和层析法的10.25 mg/mL.     

抗磷酸酪氨酸抗体的制备

目的；制备抗磷酸酪氨酸抗体。方法：以EDC（碳化二亚胺）交联法合成磷酸酪氨酸牛血清白蛋白（P－Tyr－BSA）；以P－Tyr－BSA免疫新西兰免，抗血清经硫酸该盐析和DEAE纤维素柱层析纯化；以琼脂糖双扩法测定抗体效价。结果：得到抗血清效价为1：32，抗血清与牛血清蛋白（BSA）交叉反应的效价为1：2。纯化的抗体与磷酸酪氨酸牛血清白蛋白、磷酸酪氨酸卵清蛋白、磷酸丝氨酸牛血清白蛋白、磷酸苏氨酸牛血清白蛋白反应效价分别为1：32、1：16、1：2、1：2，所得抗体蛋白量为120mg。纯化的抗体在醋酸纤维素薄膜上电泳为单一区带。结论：用此法制备得的抗体专一性高，交叉反应低，抗体量大。     

杨树花叶病毒的酶联免疫吸附分析

用酶联免疫吸附分析(ELISA)双抗体夹心法,研究杨树花叶病毒(PMV)的定量测定。用纯化的 PMV 免疫家兔,抗血清效价经环沉测定为1:1280。用硫酸铵沉淀 DEAE——纤维素(DE—32)离子交换层析法提纯 IgG 抗体。辣根过氧化物酶标记。采用戊二醛二步法标记抗体。在本实验条件下,抗体最适包被浓度为5—6微克/毫升,标记抗体最适浓度为4     

检测传染性支气管炎抗体NP-ELISA方法的建立

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的检测IBV抗体的间接ELISA方法;【方法】以表达的重组IBVNP蛋白为包被抗原,将之包被于聚苯乙烯酶标板上,以封闭液进行封闭,然后加待检血清在37℃作用1h,洗涤后加酶标兔抗鸡IgG抗体,在37℃作用1h,加底物显色,终止反应后测定OD值;【结果】抗原包被浓度为1.45μg/ml,待检血清最佳稀释度为1:40,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,确定阳性判定标准为OD450≥0.314。NP-ELISA与AIVH9、H5、H7、IBD、ND、EDS76的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性;【结论】NP-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好、方便快速的特点,可用于临床IB抗体的检测。     

己烯雌酚酶联免疫检测方法的建立

建立灵敏度高和特异性强的己烯雌酚残留检测分析方法。用人工合成的己烯雌酚免疫原多次免疫家兔,获取高效价抗体。纯化抗体经生物素标记,可同辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素特异结合。采用纯化的抗体包被96孔板,形成固相抗体。加入不同浓度的己烯雌酚标准品后,再加入生物素标记抗体,以酶标记亲和素作为探针,经酶底物显色反应可获得良好的ELISA标准曲线。该方法检测灵敏度为0.125 ng/mL,可定量检测范围为0.25~15.60 ng/mL。该方法操作简便,具有较强灵敏度和特异性,可满足实践中一般样品的残留检测。     

斑点免疫金渗滤法检测鸭肝炎病毒的研究

用胶体金标记提纯后的兔抗鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）ＩｇＧ，建立了一种以微孔滤膜为固相载体，以红色胶体金为标记物的检测ＤＨＶ的斑点免疫金渗滤法（ＤＩＧＦＡ），并确定了最佳试验条件。该法既可定性，亦可定量，对纯化ＤＨＶ的最小检测量为４．１２ｎｇ／点，其敏感性为抗原斑点试验（ＡＳＴ）的２倍。特异性阻断试验和交叉反应试验证明ＤＩＧＦＡ检测ＤＨＶ具有较高的特异性。对ＤＨＶ鸡胚尿囊液ＤＩＧＦＡ法检出率为１００％。ＤＩＧＦＡ和ＡＳＴ法对３６份临床样本检测阳性率分别为８３．３％和７５％，其阳性符合率为８６．７％。随机抽样的６份ＤＩＧＦＡ阳性肝脏样本经人工发病试验后电镜检查，均发现大量直径３０～４０ｎｍ的病毒粒子。实验结果表明，ＤＩＧＦＡ法是一种微量、敏感、特异、快速、简便的检测ＤＨＶ方法。     

鸭瘟病毒单抗的制备及胶体金试纸条检测方法的建立

【目的】鸭瘟（DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的一种急性、败血性传染病,以头颈肿胀、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黄白色溃疡,头颈部皮下有黄白色胶冻样渗出为特征。该病一旦发生,发病急、死亡快、死亡率高,对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的重要措施之一,可以及时确定病原,以便采取有效的防制手段。试验旨在建立鸭瘟病毒（DPV）胶体金快速检测方法。【方法】利用生物学软件Protean分析,选择鸭瘟病毒抗原表位较多的一段序列设计引物,PCR扩增目的基因。连接到载体pMD-18T上,测序正确后再连接到原核表达载体pET-28a上。将获得的重组质粒转化至Rosetta感受态细胞中进行诱导表达。表达的蛋白经纯化后测其浓度并经Western blotting鉴定分析。以表达的DPV-gB蛋白作为抗原,免疫7周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获得DPV-gB特异性单克隆抗体。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以制备的 H6F6单抗作为标记抗体（标记的最适pH为8.0-8.5,最佳标记浓度为15倍原液稀释）,将纯化的A8D7单抗（浓度为2倍原液稀释）和羊抗鼠IgG（浓度为10倍稀释）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线和质控线,经条件优化建立了鸭瘟病毒胶体金试纸条检测方法。【结果】共获得4株能稳定分泌抗DPV-gB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。间接ELISA检测腹水效价分别为1:10³、1:10³、1:10⁵、1:10³。亚类鉴定结果分别为IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,轻链均为kappa链。Western blotting结果显示4株单抗均能与DPV-gB蛋白特异性结合。IFA结果显示制备的4株单抗是针对DPV产生的。建立的胶体金试纸条方法能够特异性地检测鸭瘟病毒,与鸭坦布苏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、呼肠孤病毒、减蛋综合征病毒无反应。阳性尿囊液稀释50倍后用该试纸条检测依然为阳性;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异。利用制备的胶体金试纸条和PCR方法对38份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为91.6 % 。【结论】本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,可用于DPV的快速检测。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

牛轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的牛轮状病毒(BRV)分别免疫鼠和兔,制备了鼠抗BRV和兔抗BRV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测BRV的双抗体夹心ELISA方法.该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:兔抗BRV IgG包被浓度为10μg·mL-1,鼠抗BRV IgG工作浓度为5 μg·mL-1,样品反应时间60 mi...     

小西葫芦花叶病毒(ZYMV)抗血清制备及检测技术研究

从小西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)免疫的母鸡蛋卵黄和兔抗血清中分别提取免疫球蛋白IgY和IgG,用多种血清学方法进行检测。结果表明,免疫鸡和兔25d后,鸡蛋卵黄IgY和兔抗血清的效价分别达到1/64和1/512。在琼脂扩散试验中,当抗体稀释28倍时,与抗原反应无明显沉淀线。在胶乳凝集试验中,抗体稀释210倍时,与抗原反应无明显凝集物。ELISA法以辣根过氧化酶标记抗体IgY和IgG,用双抗夹心法成功地检测出了ZYMV,当抗体稀释106倍时,与抗原反应仍呈阳性。免疫电镜方法检测ZYMV,较一般血清学方法可多捕捉50倍的病毒颗粒。     

牛病毒性腹泻病毒夹心ELISA快速检测方法的建立与初步应用

用增殖与浓缩后的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分别免疫健康牛犊和家兔,制备牛抗BVDV和兔抗BVDV超免疫血清,并用层析法纯化牛抗BVDV IgG和兔抗BVDV IgG,建立了检测BVDV的双抗体夹心ELISA快速检测方法.结果表明:该检测方法的最佳反应条件为:牛抗BVDV IgG包被浓度为100μg/mL,兔抗BVDV IgG最佳工作浓度为50μg/mL,样品反应时间为90min,酶标抗体工作浓度为1∶8 000,以D490nm≥0.177作为阳性判定标准.该ELISA检测方法的重复性CV小于10%,最低检测限为1.87μg/mL,与牛轮状病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、犊牛大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温下至少可保存6个月.用该ELISA方法和IDEXX公司抗原检测试剂盒对甘肃省不同地区牛场156份临床粪便样品进行了检测,阳性检出率分别为17.3%和16.7%.表明本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性高且重复性好,可用于BVDV的快速检测.     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究

采用摩擦接种和PEG沉淀法对侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV)进行了提纯,提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线,D260 nm/D280 nm=1.236;利用提纯的CMV免疫大白兔制备抗血清,经微量沉淀法测定,其效价为1∶1024;用硫酸铵沉淀法提纯IgG,制备了辣根过氧化物酶标抗体,利用自制抗血清对DAS-ELISA、间接-ELISA和DIBA-ELISA检测侵染观赏百合的CMV灵敏度和检测范围进行了比较试验,结果表明DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是间接-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4倍;间接-ELISA和DIBA-ELISA的检测范围比DSA-ELISA宽.对21个观赏百合样品的CMV检测结果表明,DIBA-ELISA的检出率为66.67%,间接-ELISA的检出率为38.09%,二者的检出率分别比DAS-ELISA的检出率(23.81%)提高了42.86%和14.28%.     

抗沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)单克隆抗体的制备及初步应用

制备抗沙眼衣原体(CT)单克隆抗体,建立沙眼衣原体的胶体金免疫层析快速检测方法。采用纯化沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)免疫Balb/c小鼠,选取高效价的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA检测筛选分泌抗MOMP单克隆抗体(McAb)的细胞株并进行相关鉴定。共获得分泌IgG1,IgG2b和IgM的3株单克隆抗体杂交瘤细胞株。纯化的单克隆抗体与鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体均无交叉反应。通过位点分析选择配对良好的两株McAb,制备检测CT的双抗体夹心法免疫层析试纸条。制备的胶体金试纸条对MOMP的最低检出值可达50 ng·mL-1。