大肠埃希氏菌表达FMDV3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌，高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV3AB非结构蛋白进行纯化，经SDS—PAGE分析，3AB融合蛋白纯度达90％以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性，通过Westernblotting分析，表明复性后的3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明，复性后的3AB融合蛋白有很好的抗原活性。     

口蹄疫病毒VP1基因的克隆及结构蛋白VP1的原核表达

根据Genbank中的O型口蹄疫病毒全基因序列设计了一对扩增口蹄疫病毒VP1基因的引物，用该特异性表达引物从口蹄疫阳性质粒pMD—P1中扩增得到目的基因VP1（639bp）。用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体PET32a后构建重组表达载体．转化宿主菌BL21（DE3），经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆．测序证明目的基因正确插入了表达载体，用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达，收集菌液进行SDS—PAGE电泳，Westerll—blotting分析蛋白免疫原性。结果表明，VP1结构蛋白在大肠杆菌中表达量较高，表达产物的分子量约为41Ku，并能被口蹄疫阳性血清所识别，经分析表达蛋白约占菌体蛋白的34％。口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有免疫原性。     

结构蛋白VP3第56位精氨酸对口蹄疫病毒O1Ca特性的影响

口蹄疫病毒O1亚型在不同的生长环境中会抗原变异,尤其是结构蛋白VP3第56位氨基酸的变异具有重要意义。在选择压力下,该位置产生组氨酸(H)或精氨酸(R)突变,可影响病毒在体外的噬菌斑形态和体内致病性。本研究利用反向遗传学技术,构建了仅VP3第56位变异的口蹄疫病毒O1Ca,分别突变为H或R(O1Ca-VP3-56H和O1Ca-VP3-56R),并对其在体外的表型和对自然宿主中的致病性进行研究。这两种病毒在体外表现为相似的生长动力学,但有不同的温度敏感性(ts),并对牛和猪有明显不同的致病性。O1Ca-VP3-56H对热稳定,并能诱导产生口蹄疫临床症状;而O1Ca-VP3-56R为ts表型,且不致病,除非VP3第56位在体内回复突变为组氨酸或半胱氨酸。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV-L1和FMDV-L2的RNA，用1对通用引物经RT-PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段，将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM-T Easy中，转入大肠埃希氏菌JM109，得到大量携带目的基因的质粒；经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列；利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV—L1和FMDV-L2以及作为参考毒株的A22／India／17／77进行序列分析。结果表明，核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列，氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG-βH环内，其中毒株FMDV-L1和FMDV-L2 RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异，分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP2-3-1基因的克隆及原核表达

根据口蹄疫病毒（FMDV）china99流行毒株基因序列设计特异引物，以阳性质粒pGEM—p1为模板，扩增p1基因。p1片段经Nco1和Xho1酶消化后，得到目的基因VP2—3—1，将其与经相同酶消化的表达载体pProEx—HTb连接并转化BL21（DE3），经PCR、酶切鉴定和序列分析筛选阳性克隆，经IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果表明VP2—3—1基因得到表达；Western blotting结果显示，该表达蛋白能被口蹄疫病毒阳性血清所识别。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的体外表达鉴定与蛋白结构分析

口蹄疫病毒为小RNA病毒科属的成员。其基因组为一约含8500个核苷酸的正链RNA，只有1个开放阅读框，编码1个原始翻译产物，该产物可被蛋白水解酶裂解为几个分子量较大的前体，包括P1、P2、P3、P4等。P1又可被病毒编码的蛋白水解酶裂解为VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白单位。由于VP1暴露于病毒颗粒的表面，所以研究工作最多的是VP1。该基因位于FMDV基因组的2977～3615核苷酸，编码213个氨基酸。     

牛口蹄疫病毒VP2结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

为建立牛口蹄疫(FMD)抗体的检测方法,本研究将口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因,通过pPROEXTM HTb表达载体在大肠杆菌DH5α中表达,获得大小为35ku的重组VP2蛋白(rVP2),western blot证实rVP2可与FMDV5种血清型的牛阳性血清发生特异性反应。以纯化复性的rVP2为抗原建立了FMDVrVP2间接ELISA方法。重复性试验证实批内、批间变异系数均小于10%。特异性交叉试验表明,该抗原不与常见的其他7种牛病阳性血清发生交叉反应。检测非免疫无口蹄疫国家牛阴性血清的特异性为100%;检测感染血清敏感性为97.3%;检测O-AsiaⅠ的二价苗免疫牛血清,与4种商品化试剂盒比较,其符合率分别为69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。实验结果表明建立的ELISA方法可以用于口蹄疫感染和免疫抗体检测。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白3A-3B1-3B2抗体ELISA检测方法的建立

为建立检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的间接ELISA方法,通过优化抗原表达条件,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。该方法对其他相关的羊类病毒病原无交叉反应,其重复性组内与组间变异系数均低于10%,具有良好的重复性。对300份临床血清样品进行检测,与国内市售的口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒进行比较,阳性样品符合率为96.67%,阴性样品符合率为94%,总符合率为95.33%。本研究建立的羊血清中口蹄疫病毒3A-3B1-3B2蛋白抗体间接ELISA检测方法,特异性高、敏感性强,操作简单快速,具有较高的应用推广价值。     

口蹄疫病毒结构蛋白P1研究进展

口蹄疫病毒P1基因编码的结构蛋白是构成口蹄疫病毒衣壳的基础，对诱导动物机体产生中和抗体和其他保护性免疫反应有重要作用。文章综述了口蹄疫病毒结构蛋白的结构、抗原特性以及利用重组P1基因制备口蹄疫新型疫苗和诊断检测制剂的最新研究进展。     

口蹄疫病毒VP1基因研究进展

口蹄疫病毒VP1基因是参与构成病毒粒子的主要中和抗原基因,其表达蛋白可以诱导动物机体产生中和抗体。对VP1基因进行分析,不仅对口蹄疫病毒遗传变异的研究具有指导作用,而且对口蹄疫的流行病学调查、疫源追踪、毒株型和亚型的分析,甚至对新型疫苗的研制也具有重要意义。因此,VP1基因一直是口蹄疫病毒分子生物学研究领域中的热点。文章就口蹄疫病毒VP1基因的特性及其在基因分型、诊断和疫苗研究中的应用进行了综述。     

2株O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的核苷酸序列分析

口蹄疫(Food and mouth disease,FMD)是由小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物传染病,人也易感,对畜牧业危害极大。病原的变异性高,存在7种血清型(O,A,C,ASI-A1,SAT1-3)和多种亚型,群内各型同源性达60%~70%,但两群之间     

口蹄疫病毒P1结构蛋白和3A非结构蛋白研究进展

口蹄疫病毒(FMDV)P1基因所编码的结构蛋白是FMDV衣壳的主要蛋白,是其主要抗原位点所在的区域,决定着FMDV的抗原性,3A非结构蛋白能与宿主细胞结合,其特征性变化与病毒的表型变化密切相关,影响着宿主嗜性和致病力,P1和3A基因都是FMDV研究的热点。论文综述了FMDV P1和3A基因及其所编码蛋白的结构、抗原特性及其生物学功能的研究现状,为后续FMDV研究提供参考。     

口蹄疫病毒VP2基因的原核表达及抗原性检测

将口蹄疫病毒VP2基因连接到原核表达载体pPROEX^TM HTb上，获得重组质粒pPR-VP2。将此质粒转化感受态菌DH5α中，经终浓度为1．0mmol／L的IPTG诱导，1h～6h依次收集菌液，SDS-PAGE电泳分析，在4h后表达量可达到高峰。经过软件分析，表达产物占总菌体蛋白的23．1％，大小为33Ku左右。根据Ni-NTA纯化系统说明操作，获得较纯的VP2融合蛋白。以牛抗O型口蹄疫病毒血清为第一抗体，通过Western blot和Dot ELISA鉴定，纯化后的VP2融合蛋白可以与牛抗O型口蹄疫病毒血清发生特异性反应。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV)C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法，获得了可溶性的纯化蛋白E2，其纯度达70％，回收率为10％。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测，结果表明，其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达与抗原性分析

研究分析了O型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1与当前猪FMDV疫苗血清的免疫反应性.将VP1基因克隆至原核表达载体pET32c,并在大肠埃希菌BL21中得到了表达,Western blot分析表明该重组蛋白与豚鼠O型FMDV标准阳性血清具有良好免疫反应性.目的蛋白经纯化后用ELISA分析其与猪疫苗血清的免疫反应性,结果显示该重组VP1蛋白(rVP1)只能与部分O型FMDV疫苗血清反应.推测当前使用的不同O型FMDV疫苗毒株在VP1重要中和抗原位点G-H环(134 aa～158 aa)与C末端(200 aa～213 aa)存在较大差异.     

杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及免疫原性评估

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白,能诱导宿主产生特异性免疫应答。口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。利用杆状病毒表面展示系统,将这2种病毒蛋白与猪CD40配体(CD40 ligand,CD40L)进行融合表达并展示在杆状病毒表面,构建了rv Ac-Cap、rv Ac-VP1和rv Ac-Cap-VP1 3种重组杆状病毒。通过SDS-PAGE和Western blotting检测3种重组杆状病毒感染的Sf9细胞总蛋白,证明3种融合蛋白成功表达。纯化的重组杆状病毒颗粒以1×108pfu/只的剂量免疫接种BALB/c小鼠,通过间接ELISA检测血清中Cap和VP1的抗体浓度,证明表面展示有Cap和VP1的重组杆状病毒能激发小鼠产生较高水平的抗体,与PCV2和FMDV商品化疫苗免疫组的抗体浓度差异不显著(P0.05),表明该重组杆状病毒具有较好的免疫原性。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体pBAD／TOPO中，经鉴定后得到了重组质粒pBAD-VP1。将此重组质粒转化到受体茵TOP10中，分别以不同浓度的诱导剂L-阿拉伯醛糖进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。结果，以终浓度为0．02g／L的L-阿拉伯醛糖进行诱导，4h后表达可达到高峰，表达产物大小约为40ku。软件扫描结果显示，VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的26．3％，能与抗FMDV抗体发生特异性反应，融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体，经过洗涤后制成油乳荆疫苗，经皮下注射免疫豚鼠，用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数，并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明，用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体，并对病毒的攻击提供免疫保护。