玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

玉米雄性不育突变体ms1153的遗传分析与基因定位

以玉米雄性不育突变体ms1153为材料,通过减数分裂期花粉母细胞染色体观察和不同发育时期花药石蜡切片分析突变体不育表型产生的原因,利用F₁和F₂群体确定突变体MS1153的遗传方式和基因ms1153物理位置。结果表明,与野生型相比,突变体植株在营养生长期无明显差异,在生殖生长阶段花药不能从颖壳外露,成熟花粉粒内无淀粉积累。细胞学分析发现,突变体减数分裂过程正常,但减数分裂后绒毡层降解推迟。遗传分析表明,突变体ms1153的不育性状受1对隐性核基因控制。利用图位克隆的策略将MS1153基因定位于玉米第4染色体分子标记8243与8275之间,物理区间为221.4~226.2 Mb,此区间内没有已克隆雄性育性基因,说明MS1153是一个新的玉米雄性育性基因。     

玉米雄性不育基因Zmms1的同源克隆及生物信息学分析

利用水稻雄性不育相关基因Osms1同源克隆玉米中的同源基因Zmms1,用生物信息学方法对水稻Osms1及玉米Zmms1基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明,水稻雄性不育相关基因Osms1编码区长度为2 232 bp,编码679个氨基酸,Zmms1编码区长度为2 461 bp,编码670个氨基酸。通过对ms1蛋白功能结构域进行分析发现,Zmms1和Osms1同为PHD-ZF超家族成员,二者具有相同的功能结构域和近似的三级结构,因此推测,Zmms1可能与Osms1具有相似的功能。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

玉米花粉管通道法转化脱水素BDN1基因

通过花粉管通道法将脱水素基因BDN1转入玉米自交系合344中,并对转化后代进行PCR和RT-PCR分子检测以及耐盐性功能鉴定,筛选耐盐性较高的转基因玉米新种质.结果表明,实验共获得88株T0代除草剂抗性植株,其中31株PCR检测呈阳性,14株RT-PCR检测呈阳性,对T4代转基因株系苗期进行300 mmol/L NaCl溶液的盐胁迫处理, 2个转基因株系耐盐性比对照提高两个级别.     

玉米氮胁迫响应NRT基因的鉴定及ZmNRT2.5的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(Nitrate Transporters,NRTs)在植物根系NO₃^-吸收或转运中发挥重要作用。为探究玉米NRTs基因在氮素吸收中的功能,从前期转录组数据中鉴定出7个响应氮素处理的差异表达ZmNRTs基因。启动子顺式作用元件分析表明,这些ZmNRTs基因的启动子均含有多个植物逆境或激素应答元件,推测他们可能与玉米非生物胁迫应答或植物激素调控氮素吸收相关。从玉米根系中克隆了对氮素处理响应最大的ZmNRT2.5,该基因CDs全长为1 563 bp,编码520个氨基酸。进化树分析结果表明,ZmNRT2.5与AtNRT2.5同源性最高,含有保守的硝酸盐转运结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,含11个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析表明,ZmNRT2.5主要在根、老叶和叶鞘中表达。低氮处理显著诱导ZmNRT2.5在根中的表达,植物激素脱落酸、赤霉素和乙烯均参与调控ZmNRT2.5的表达。同时,ZmNRT2.5基因的表达受到盐胁迫的显著抑制。     

玉米株型相关基因ZmDwarf4的克隆及表达分析

以松散型玉米自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆与水稻Dwarf4基因同源的玉米Dwarf4基因。序列分析发现,该基因cDNA序列全长1 626 bp,开放阅读框1 521 bp,编码506个氨基酸,与高粱、水稻、拟南芥的氨基酸同源性分别为95%、89%和71%。Real-Time PCR分析表明,ZmDwarf4基因的表达量为3～11叶期表达量逐渐增加,9～11叶期达到最大量,12～19叶期表达量逐渐降低,推测ZmDwarf4基因正向调控玉米叶夹角的大小。ZmDwarf4基因的表达量在叶片中最高,在叶枕中最低。不同激素处理的结果表明,用植物激素（IAA）处理的样品ZmDwarf4基因的表达量始终高于对照;用Brassinolide（BR）处理的样品6叶期ZmDwarf4基因的表达量高于对照,7～10叶期该基因的表达趋势与对照基本一致,但始终低于对照;用IAA+BR处理的样品,该基因的表达趋势与对照基本一致,但高于对照。ZmDwarf4参与玉米BR生物合成途径,进而调控其相关株型建成。     

玉米PRC2基因在子粒发育过程中的表达分析

以玉米自交系昌7-2授粉后不同天数的玉米子粒为研究对象,通过实时荧光定量PCR技术,对玉米中3个Polycomb Repressive Complex 2基因(PRC2)Mez1(Maize enhancer of zeste 1)、Fie1(Fertilization independent endosperm 1)和Vef101(VEF family protein 101)在授粉后不同天数的表达情况进行研究。结果表明,Mez1、Fie1和Vef101在授粉后子粒发育不同阶段均有表达,Fie1在子粒发育过程中呈先上升后下降的趋势,授粉后10 d表达量最高,表明Fie1可能在子粒由胚胎形成到干物质积累的过渡时期发挥调控作用;Mez1在子粒发育过程中呈先下降后上升的趋势,授粉后10 d表达量最低,子粒发育后期表达量明显上升,表明Mez1可能在子粒淀粉积累过程中发挥调控作用;Vef101只在授粉后5 d的子粒中呈现高表达,其他时期表达量均较低,表明Vef101可能在玉米子粒发育早期胚胎形成过程中发挥调控作用。     

玉米ZmCPB1基因的克隆、表达及生物信息学分析

从玉米中克隆ZmCPB1基因的cDNA序列,全长1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质理论分子量为54.05 KD,等电点为8.59。生物信息学分析表明,ZmCPB1蛋白N端有跨膜结构,是跨膜蛋白。蛋白质二级结构含有48.44%的α-螺旋、4.99%的β-转角、10.60%的延伸链以及35.97%的无规则卷曲,该蛋白定位于内质网中。序列比对结果显示,ZmCPB1蛋白含有与子粒发育相关的保守区VKFVHRKALK。系统进化树分析表明,该蛋白与高粱、谷子、水稻和大麦的同源蛋白亲缘关系最近,同属一个亚支。实时荧光定量PCR分析ZmCPB1基因的表达模式,结果表明,ZmCPB1基因在3叶期的根、茎、叶以及雄穗和苞叶中表达量较低,在雌穗中的表达量较高。在玉米子粒发育的不同时期,ZmCPB1基因的表达量呈现一定的规律变化,在授粉后0～10 d,表达量逐渐达到最高峰,之后开始下降,在授粉15 d后降到较低水平。初步判断ZmCPB1基因与玉米子粒早中期发育有关。     

玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf5的抑制基因的发现与鉴定

利用一个含有单基因Rf5的恢复系6233与6个C型不育系杂交，发现杂交组合Cms-C77×6233表现不育，(Cms-C77×6233)×6233的育性表现1∶1的分离，推测在不育系Cms-C77中存在一个显性抑制基因Rf-I，该基因只对恢复基因Rf5具有抑制作用。因此在玉米C型胞质雄性不育的三系选育过程中，为避免不育系背景中可能存在抑制基因的影响，应选择含有恢复基因Rf4的材料作为供体进行恢复系的选育工作，可以克服有些不育系的恢复系选育较难的问题。     

玉米DCL1基因鉴定及其自然等位变异分析

根据生物信息学分析,同源性克隆分离玉米DCL1候选基因,鉴定该基因组织与逆境响应等表达特征,并分析其自然等位变异。结果表明,目标候选基因全长7 408 bp,与拟南芥和水稻DCL1基因氨基酸序列高度保守,相似度分别为91%和77%。mRNA定量PCR分析表明,该基因在幼叶和吐丝期雌穗中表达丰度分别是幼茎的75.35倍和16.21倍;高盐、脱水、ABA、低氮、低磷胁迫处理条件下,幼苗中高盐和ABA处理呈下调表达,低氮和低磷处理呈显著上调表达,脱水处理无显著变化。核苷酸与氨基酸序列的保守性、组织与逆境响应差异表达特征均与拟南芥和水稻等相似。87份玉米自交系10×全基因重测序数据分析结果表明,该基因遗传变异丰富,共83个位点存在自然变异,但外显子区域和主要的功能结构域序列相对保守,约2/3的自然变异集中在内含子区域,外显子区域的27个自然变异位点只有8个位点在16个材料存在氨基酸差异。     

玉米ZmFAR1基因的克隆与表达分析

FARs为脂酰辅酶A还原酶,在植物生长发育和抵御非生物胁迫过程中起着重要作用。为进一步研究FARs在玉米中行使的生物学功能,在玉米中克隆1个脂酰辅酶A还原酶1基因(ZmFAR1),该基因全长1 883 bp,开放阅读框长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为55.983 k Da。生物信息学分析表明,ZmFAR1蛋白的分子式为C₂₅₂₂H₄₀₁₀N₆₉₀O₇₀₁S₂₄,为稳定的碱性亲水蛋白,存在59个磷酸化位点,未发现信号肽,存在跨膜结构域,最大可能定位于细胞质。氨基酸残基组成中主要以α螺旋和无规则卷曲为主。系统进化树分析表明,ZmFAR1蛋白与南荻和高粱的FAR蛋白相似度最高。利用实时荧光定量PCR技术对ZmFAR1在模拟盐、干旱两种非生物胁迫条件下对根、茎、叶3种组织的表达模式进行研究,结果表明,ZmFAR1呈现组织特异性表达,在叶中的表达量最高。盐和干旱处理下,ZmFAR1的表达量出现明显变化,推测ZmFAR1可能在不同程度参与了玉米对非生物胁迫的应答。     

玉米大斑病菌StPEX11基因家族的鉴定及生物信息学分析

PEX11基因家族成员是参与过氧化物酶体增殖调控的关键因子。在玉米大斑病菌基因组中鉴定出2个PEX11基因,根据其相对分子质量分别命名为StPEX11-1和StPEX11-2。利用生物信息学方法,对基因结构、蛋白质的保守结构域及理化性质进行分析,预测其二级结构域。系统发育树分析发现,玉米大斑病菌的2个StPEX11基因分别属于I型和III型的PEX11亚家族。     

玉米CYP基因家族全基因组鉴定及进化与表达分析

利用NCBI中多物种基因组信息以及多种生物软件或在线工具,对玉米CYP基因进行生物信息学分析。结果表明,共鉴定得到23个玉米CYP基因,这些基因不均衡的分布在玉米1～8号染色体上。亚细胞定位分析表明,23个ZmCYPs定位于细胞的不同部位。多物种CYP蛋白进化树将CYP家族蛋白分为9个分支,玉米与高粱中的CYP蛋白多聚类在一支。基因家族内系统进化树联合基因模式图分析表明,处于同一进化分支上的ZmCYPs基因存在基因结构相似而组织表达模式不一致的现象,说明ZmCYPs基因在玉米中功能既存在保守性也存在分歧。对玉米CYP家族蛋白进行motif分析,结合蛋白多序列比对后发现,只有部分ZmCYPs保留了完整的活性位点。启动子顺式作用元件的分析表明,ZmCYPs可能参与光响应及多种非生物胁迫信号通路。对ZmCYPs进行高光强表达谱分析发现,部分ZmCYPs基因表达在高光强环境下受到诱导,表明部分ZmCYPs可能参与玉米在高光强下的适应过程。     

郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点分析与高效分子标记开发

opaque2突变体材料是最常用的高赖氨酸玉米供体。对已获得的郑58/o2近等基因系研究表明,胚乳发育不同时期22-kDα-醇溶蛋白的积累均明显低于郑58。荧光定量PCR结果表明,α-醇溶蛋白家族基因Z1A、Z1B、Z1C和Z1D的表达均显著低于郑58。郑58/o2胚乳发育不同时期Opaque2基因均正常表达。测序分析发现,郑58/o2中o2基因ATG后713 bp处缺失10个碱基,ORF预测Opaque2蛋白翻译提前终止。针对突变缺失位点开发基因内分子标记o2-indel-1,利用该标记进行回交转育,结果表明,o2-indel-1与o2突变表型完全连锁,错选率为0。opaque2基因突变位点的解析有助于高效分子标记的开发,有效降低错选率,提高优质蛋白鲜食玉米多基因聚合育种的选择效率。     

玉米opaque2近等基因系中相关基因的表达量分析

Opaque2(O2)基因编码产生OPAQUE2蛋白,该蛋白为碱性亮氨酸拉链家族的一种转录因子,可作用于基因的启动区,调控基因的转录。辽2345/o2为本实验室构建的辽2345的opaque2(o2)基因回交导入系,蛋白组学分析表明,辽2345与辽2345/o2在授粉后18 d的胚乳细胞中表达蛋白的种类和数量存在很大差异,从中筛选出差异较明显的9种蛋白质。为了进一步验证O2与9种蛋白间的作用关系,应用相对荧光定量PCR的方法对9种蛋白进行了RNA水平表达量的检测。结果表明,在胚乳发育过程中Chfi很可能受到O2的抑制作用,O2很可能对Ubc、Lgl、Sdh、LOC541920、Shmt、Ppdk等基因存在某种促进或激活作用。     

玉米弯孢叶斑病菌RhoGAP基因家族的全基因组鉴定与生物信息学分析

RhoGAPs(GTPase activating proteins)通过与Rho GTP酶结合,促使GTP酶水解成Rho GDP无活状态,在生物体中调控着重要的生物学功能。在全基因组上对玉米弯孢叶斑病菌(C.lunata)中RhoGAP基因家族成员进行鉴定,对其序列特征分析。结果表明,玉米弯孢叶斑病菌(C.lunata)有5个RhoGAP基因家族成员,分布在5不同的Scaffold上,其基因结构分析显示,外显子和内含子大小与位置均不一样,表现出复杂的基因结构。序列比对和系统进化分析发现,5个RhoGAP氨基酸序列与其他真菌来源的RhoGAP一样具有特征性保守序列区,与粗糙脉胞菌(N.crassa)和小麦黄斑叶斑病菌(P.tritici-repentis)的RhoGAP蛋白关系密切,其亲缘关系最近。