A 蛋白酶联法检测植物病毒的研究

用一种动物的特异抗体,与市售 A 蛋白(SPA)、A 蛋白酶标记物(HRP-SPA)组合成 A 蛋白酶联免疫吸附试验(SPA-ELISA)检测南方菜豆花叶病毒(SBMV)、烟草花叶病毒(TMV)纯化抗原和病株粗澄清液,灵敏度分别为0.128μg/ml 和1:10000。使用的 A 蛋白包被的适宜工作浓度为2.5μg/ml,兔抗 SBMV 血清作第一抗体适宜工作浓度为1:100000,作第二抗体适宜工作浓度为1:1000。检测 TMV 也得到相似的结果。该法的灵敏度是 ELISA-异种动物抗体双夹心法的1～25倍;是 ELISA 间接法的10～125倍;是免疫双扩散法的3000～6000倍。应用这种酶联法既不需要纯化抗体、也不要自己制备酶标记抗体,又不需要制备第二种动物特异抗体就可以得到酶联双抗体夹心法和异种动物抗体双夹心法相似或更好的结果,使 ELISA 更适于在植物检疫上推广应用。     

应用单克隆抗体检测大麦黄花叶病毒

作者应用已建立的大麦黄花叶病毒(BaYMV)的4F_(10)单克隆抗体杂交瘤细胞株,经小白鼠腹水生产单克隆抗体,用过碘酸钠法制备了辣根过氧化物酶标记的酶标单克隆抗体。并由此建立了检测大麦黄花叶病毒的标准的双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)。其检测提纯病毒的灵敏度为3.0μg/ml左右,感病大麦叶片汁液的最大稀释度为1:2560,病茎稀释度为1:160。对采自我国7个主要BaYMV发病区感病的样品进行了检测,绝大多数均显示强阳性,只有宝山样品例外。本项试验为BaYMV诊断的标准试剂盒的建立进行了有益的尝试。     

A-蛋白结合乳胶粒子的乳胶凝集试验检测植物病毒研究

用 A-蛋白结合乳胶粒子,再吸附烟草坏死病毒(TNV)抗血清中的免疫球蛋白 G(IgG),制成乳胶致敏抗体复合物。这种复合物可检测病株粗提液和部分提纯液中的 TNV,它们的灵敏度分别为1:4096和0.625微克/毫升。特异性强。该方法也适用于白三叶草花叶病毒(WCMV)、大豆花叶病毒(SMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)等的检测试验。     

我国大麦条纹花叶病毒的研究Ⅰ.用ELISA方法检测麦种中的大麦条纹花叶病毒

 用ELISA检测麦种中的大麦条纹花叶病毒(Barlcy stripe mosaicvirus BSMV)方法简便,灵敏度高,检测抗原的最高灵敏度可达10毫微克/毫升。一粒麦芽稀释1000倍还有阳性反应,也能测出带毒麦粒的种皮、胚和胚芽等部位中的BSMV。另外,还检测了国内外的部分麦种,其中来自新疆、北京、江苏和丹麦的小麦品种中存在BSMV。     

用A蛋白免疫电镜快速检测几种蔬菜作物的两种杆状病毒

 应用A蛋白免疫电镜技术对几种蔬菜作物的长叶车前草花叶病毒(RMV)、烟草花叶病毒(TMV)的检测比常规的电镜负染技术至少要灵敏近10,000倍,比普通的免疫电镜技术要灵敏10~100倍,抗血清浓度稀释至400,000倍,病毒粗提液稀释到1,000,000倍或病毒提纯液浓度为2.5×10^-7 mg/ml时均能观察到病毒粒子。同时由于抗体分子能特异性地结合到病毒粒子表面,能够很容易地区分不同的病毒种类。
应用此项技术作者检测了杭州地区几种常见的蔬菜病毒病,对大白菜(Brassica campestris L.),蕃茄(Lycopersicum esculentum Mill),榨菜(Brassica juncea var.tsatsai Mao),雪里(Brassicajuncea var.multiceps Tsen et Lee)等作物发病期的叶或果的浸提液用A蛋白免疫电镜进行快速检测,结果在大白菜,番茄等病株上检测到较多的病毒粒子,且大多能被RMV抗血清修饰,同时在番茄病株检测到的少量病毒粒子亦能被TMV抗血清修饰,而榨菜及雪里等病株上检测到的病毒粒子很少能被RMV及TMV抗血清所修饰,另外,病毒粒子的含量以番茄病果中为最高,要比其它几种蔬菜作物叶子中高约10~30倍。     

免疫电镜法测定3种Potyvirus组病毒的研究

 对大豆花叶病毒(SMA),花生斑驳病毒(PMV)和豇豆蚜传花叶病毒(CAMV)3种Potyvirus病毒进行了免疫电镜(ISEM)的测定。ISEM法同样证实了这3种病毒在血清学关系上的不同。3种病毒抗血清对同源抗原都具有"捕获"大量病毒粒体的能力,"捕获"数量是异源关系或正常血清的20~50倍.ISEM方法的灵敏度和专化性受到包被抗血清的稀释度和在抗原上处理时间等因素的影响."捕获"病毒粒体最适的抗血清稀释度是10-3或10-4;抗原处理时间,在一定范围内随处理时间的延长而增加"捕获"病毒粒体的数量,处理时间超过10-20小时即不再增加"捕获"粒体数量.同源抗体抗-抗原反应对病毒粒体上有"装饰"作用,而异源关系没有"装饰"作用。"装饰"的免疫电镜法是鉴别同源病毒的重要标准。     

ELISA—异种动物抗体双夹心法检测植物病毒及阳性判断标准的初步研究

用烟草花叶病毒(Tobacco mosaic Virus—TMV)的兔抗血清和鼠腹水抗体与市售的羊抗鼠酶标记物组合成异种动物抗体双夹心酶联免疫吸附试验(ELISA—DSM),检测用14个 TMV 分离物接种、分期采集的番茄、大椒、烟草大量样品和健康样品,磨碎制取澄清液,作系列稀释,测得每一样品各稀释度的光密度(O、D)值,统计分析,找出待检样品以稀释100倍为最适宜的稀释倍数,阳性反应判断标准以 P/N≥1.8—2为好(P 为待检样品 O·D 值,N 为阴性对照 O·D 值),检出率达96.5—95.2％,误诊率为0。     

单抗I-ELISA和TAS-ELISA检测百合无症病毒的研究

 以抗百合无症病毒(Lily symptom less virus,LSV)的单克隆抗体为核心,建立了间接ELISA (I-ELISA)和三抗体夹心ELISA (TAS-ELISA)的检测方法。I-ELISA检测体系中,病叶汁液和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1:20和1:6 000,对病叶汁液的检测灵敏度达到了1:2 560,可检测到提纯病毒绝对量为1.35 ng。TAS-ELISA检测体系中捕获抗体和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1:200和1:6 000,检测病叶汁液的灵敏度达到了1:5 120,对于提纯病毒可检测到0.68 ng。使用美国Agdia公司双抗体夹心ELISA (DAS-ELISA)检测试剂盒对病叶汁液的检测灵敏度为1:2 560,提纯病毒检出量1.35 ng。用3种ELISA方法检测了采自浙江省丽水市的46个田间样品,I-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA测出的阳性样品数分别为19、21和18个,阳性率为41%、46%和39%。灵敏度检测和田间样品检测结果显示,TAS-ELISA的灵敏度高于DAS-ELISA和I-ELISA。相同样品I-ELISA所测出的OD₄₀₅值和P/N值普遍高于DAS-ELISA,表明LSV单抗比多抗具有更强的特异性和更高的灵敏度。     

应用间接酶联免疫吸附技术对芜菁花叶病毒血清学关系的研究

 本试验收集了来自不同国家和地区的10个芜菁花叶病毒株系或分离物(TuMV)。应用直接ELISA和间接ELISA对其各株系间血清学关系进行了比较试验。直接ELISA双抗体夹心法专化性较强。由病毒抗血清所制备的结合体只与同宗抗原起反应,不与TuMV其它株系异宗抗原起反应。应用病毒抗血清所制备的F (ab')₂包被处理的间接ELISA技术,鉴定病毒不同株系血清学亲缘关系时,只要用1个病毒株系抗血清即可对不同株系进行鉴定。由6个TuMV株系分别制备的抗血清对10个毒株进行鉴定表明,各株系均能交互反应,说明株系间具有共同的抗原性,仅OM株系与其它株系较少一致性,表明血清学关系较疏远。因此认为,间接ELISA适用于广泛的病毒诊断及株系鉴定之用,比直接ELISA优越。     

酶联免疫吸附试验检测水稻条纹叶枯病介体昆虫带毒率

应用酶联免疫吸附试验的双抗体夹心法检测水稻条纹叶枯病毒,灵敏度可达125ng/ml,重复性和特异性均较满意,操作简便,试剂稳定,适用于常规检测。试验用辣根过氧化物酶与提纯的抗 RSV 抗体球蛋白交联,制得酶标抗体,以磷苯二胺为底物,最适包被抗体浓度为0.5～1μg/ml,最适酶标记抗体浓度为0.15μg/ml,能检出抗原的最低浓度;病叶澄清液稀释度为1:6400。应用酶联免疫吸附试验检测水稻条纹叶枯病介体昆虫带毒率,以生物接种测定法为对照,检测1936头灰稻虱,符合率为97.9%,在农业生产上具有实用价值。     

山东省大豆花叶病毒原及其生物学的研究

 山东省田间侵染大豆的花叶病毒,粒体线条状,大小714-729×12-13nm,粗提纯液与SMV抗血清呈阳性反应。寄主范围窄,接种5科14种植物只侵染大豆,呈系统花叶症状。体外抗性。钝化温度65-70℃,稀释限点10^-3-10^-4,体外保毒划3-4天。传毒方式:可通过种子、蚜虫和摩擦接种传毒。根据以上特性,侵染大豆的花叶病毒,毒原应为大豆花叶病毒(SMV),属于马铃薯y病毒组(Potyvirus group)的成员。     

芝麻坏死花叶病毒的鉴定

 自武昌芝麻坏死花叶病株得到1个病毒分离物,根据该分离物生物学特性、粒体形状、血清学性质、外壳蛋白分子量和核酸组分、大小,明确为自然侵染芝麻的一种新病毒,定名为芝麻坏死花叶病毒(Sesame necrotic mosaic virus,SNMV)。在人工接种7科38种植物中,SNMV侵染6科23种;体外稳定性状:稀释限点10^-4~10^-5,致死温度80~85℃,体外存活期限40d;病毒可通过土壤和接触传播。SNMV病毒粒体球状,表面有粒状突起,直径约32nm。制备病毒抗血清用琼脂双扩散方法测定效价为1:128。SNMV和红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)、甜三叶草坏死花叶病毒(SCNMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和花生矮化病毒(PSV)抗血清没有反应。病毒外壳蛋白亚基分子量为38 100道尔顿;核酸1个组分,大小约4700nt,另含RNA片段,大小约600nt,可能为卫星RNA。依据上述病毒特性,SNMV可能归属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)。     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

Improved detection of citrus psorosis virus using polyclonal and monoclonal antibodies

Citrus psorosis is a serious and widespread disease associated with citrus psorosis virus (CPsV), a novel filamentous negative-stranded virus in the genus Ophiovirus . Laborious and costly indexing on test plants has been the only routine diagnostic method available, but recently an antiserum usable in double antibody sandwich (DAS) ELISA has been prepared. Here, major improvements to the DAS-ELISA protocol, a new purification method, and production of two monoclonal antibodies (mabs) to CPsV, an IgG and an IgM are reported. A highly sensitive triple antibody sandwich (TAS) ELISA making use of the mabs is described. In glasshouse citrus the homologous virus was still detectable at a tissue dilution of 1/6250 in DAS and at 1/31250 in TAS-ELISA. Both the DAS and IgG mab-TAS formats detected all CPsV isolates so far tested (from Argentina, Italy, Lebanon, Spain and the USA). A few isolates were not detected by the IgM mab.     

南京地区豇豆蚜传花叶病毒的鉴定

 1982年5月,从南京郊区豇豆花叶病植株上分离到1株病毒分离物C-1,接种试验的结果证明,它可以侵染12种豆科和藜科植物。它在豇豆上引起系统花叶、叶片卷曲、明脉和畸形等症状。它在苋色藜、昆诺藜和蚕豆上表现为局部病斑。体外抗性测定,失毒温度55~60℃,稀释限点10^-3~10^-4,体外存活期1~2天。病毒极易摩擦接种传病。桃蚜、棉蚜和豆蚜都能传染这种病毒。人工接种的豇豆病株,在花器的各个部分、幼嫩的豆荚组织和末成熟的种子内都带有病毒。病株上采收的种子传毒率可达8.1%。病毒存在于种子的胚和子叶内,种皮内没有测到病毒。病毒粒体线条状,长700~750纤米。病株叶片表皮细胞内有纺锤状的内含体。免疫电镜和SDS~双扩散法测定,病毒分离物C-1与豇豆蚜传花叶病毒(CAMV)的抗血清呈阳性反应。根据以上这些性状,病毒分离物C-1可鉴定为属于马铃薯Y病毒组中的豇豆蚜传花叶病毒。用微量沉淀法测定,病毒粗提纯液制备的抗血清的效价为1:512。SDS-双扩散法测定,南京地区严重发生的豇豆花叶病中,85~86%是由豇豆蚜传花叶病毒引起的。从福建、山东、辽宁等省采集的样本中,也证实这种病毒在豇豆上普遍发生。     

南京地区瓜类花叶病毒的初步鑑定

 南京市郊栽种較普遍的瓜类植物中都有花叶病的为害。1956-57年的調查,一般发病率有5-10%,个别田地可达15%以上。     

玉米矮花叶病毒HC-Pro的纯化及抗血清制备

 本实验提纯了玉米矮花叶病毒(MDMV)的辅助成份-蛋白酶(HC-Pro),并制备了其抗血清。MDMV HC-Pro的分子量约为57kD,提纯产量为0.3mg/100 g病叶。琼脂免疫双扩散测定证明MDMV HC-Pro抗血清的效价为1:16;微量免疫沉淀法测定时其效价为1:1024。该抗血清只与MDMV HC-Pro有明显的反应,与健康玉米汁液和MDMV无反应。MDMV HC-Pro抗血清可以专化性地抑制HC-Pro的蚜传活性。     

北京菜豆(Phaseolus Vulgaris)上的一种新病毒—和性黄色花叶病毒

 从北京郊区患有类似花叶病害的菜豆株上分离到一种线条状病毒(长约700至750nm)并于1983至1986年间加以研究。在温室内接种可以侵染菜豆、蚕豆、豌豆、大豆、决明、苋色藜及昆诺藜而不能侵染被接种的任何茄科植物.同标准的菜豆普遍花叶病毒(BCMV)相比,它不侵染茄科植物例如黄花烟(Nicotiana rustica)和矮牵牛(Petunia hybrida)在菜豆叶上也不产生坏死枯斑.此外它能侵染蚕豆、大豆、豌豆及决明而BCMV则不能.BCMV能侵染豇豆而这一分离物则不能.此分离物的物理性状为:钝化温度=56-580℃(十分钟),硫释限点=10^-3至10^-4,180℃下存治期为3天,A260/280=1.12.菜豆受侵叶组织易用光学显微镜观察到内含体包括一种片层叠合体.在电镜下超薄切片中可以看到风轮状体.极易用汁液摩接及用桃蚜(Myzus persic(接种.此病毒的衣壳蛋白亚基的分子量经测定为32,000道尔顿.此病毒与下列病毒即菜豆普通花叶病毒,菜豆黄色花叶病毒,黑眼豇豆花叶病毒,豌豆种传花叶病毒,三叶草黄脉病毒,莴苣花叶病毒及甜菜花叶病毒的抗血清均无反应.由于它在菜豆的"一窝猴"品种的叶片上产生沿脉黄色小点,因此认为这是一种新的独立的病毒,称之为菜豆和性黄色花叶病毒.