妊娠期山羊卵巢中雄激素受体的免疫组化定位

用免疫组织化学技术对不同妊娠时期山羊卵巢组织中雄激素受体的表达及其变化规律进行研究,以探讨雄激素受体在卵巢生殖功能中的调节作用。结果显示,妊娠期黄体细胞的形态结构随所处妊娠的不同阶段而变化,退化黄体细胞数量随周期进程逐渐增多。在妊娠各时期卵巢的被膜、次级卵泡颗粒层细胞和黄体细胞均存在雄激素受体的阳性表达,从阳性反应产物定位来看,阳性反应主要位于细胞膜和细胞质内;随妊娠进程雄激素受体的表达强度逐渐减弱。     

大鼠卵巢内IFN-γ样免疫反应阳性物质的表达

应用免疫组织化学SP法结合葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵呈色法对卵巢细胞内IFN-γ的分布及表达状况进行了研究。结果显示，在卵巢的生长卵泡和成熟卵泡以及黄体内都可表达IFN-γ。在卵泡内IFN-γ存在于颗粒细胞胞质中，且在同一个卵泡中，卵母细胞周围的颗粒层细胞染色最深，最密集。在黄体内广泛分布IFN-γ样免疫反应阳性纤维，而细胞为阴性反应。阳性纤维细长，染色较弱，上有膨体。大多数纤维在膨体处分支，并弯曲、盘绕成网络样围绕在黄体细胞周围。上述结果提示，IFN-γ可能作为一种神经免疫介质参与卵巢内的免疫调节。     

雌激素及其受体调控卵母细胞成熟的研究进展

目前很多女性受到不孕不育、自然流产和出生缺陷等诸多生殖相关疾病的困扰,其主要原因为生殖细胞减数分裂异常和卵母细胞质量下降。雌激素不仅参与调控哺乳动物的发情和性行为,也参与调控卵母细胞的生长发育。雌激素受体作为类固醇激素受体的一种,在介导雌激素发挥基因组效应和非基因组效应中有着重要的作用。目前关于雌激素受体调控卵母细胞成熟的报道多集中于硬骨鱼类,特别是新型膜受体GPR30,而在哺乳动物方面的研究鲜有报道。因此作者介绍了雌激素核受体ERα、ERβ与新型膜受体GPR30的结构与分布,简述了膜受体GPR30的不同类型配体的研究进展,综述了雌激素受体在调控卵母细胞发育中的相互作用,发现雌激素的核受体与膜受体在卵母细胞成熟的过程中可能发挥不同的调控作用,并进一步阐述了雌激素及其受体在卵母细胞成熟过程中的潜在调控机制。     

免疫组化法检测促黄体素受体在多浪羊和卡拉库尔羊卵巢上的分布

为从形态学角度理解内分泌调节过程,揭示促黄体生成素(luteotropic hormone,LH)对雌性哺乳动物卵巢调节作用机制,试验采用免疫组织化学SP方法研究促黄体生成素受体(luteotropic hormone receptors,LHR)在多浪羊和卡拉库尔羊卵巢组织中的分布与表达,分别选取相邻的5张连续切片,光镜观察、图像分析。结果显示,多浪羊与卡拉库尔羊的LHR阳性物质主要见于膜细胞、卵母细胞、颗粒细胞和血管周围间质,尤其在膜细胞和卵泡颗粒细胞的胞质中分布最多。原始卵泡卵母细胞中便有LHR受体阳性物质分布,在各级卵泡中LHR阳性细胞数量和染色强度随卵泡发育呈正向增加趋势。     

梅花鹿卵巢颗粒细胞的体外培养与鉴定

卵巢颗粒细胞在卵母细胞生长和卵泡发育过程中起着重要作用,为卵母细胞提供营养,分泌孕酮和雌二醇,与膜细胞一起调控卵泡的增殖和分化。卵巢颗粒细胞也具有干细胞特性,可以作为核移植的替代物,用卵泡刺激素受体(FSHR)抗体能很快地鉴定颗粒细胞。本研究通过对梅花鹿卵巢颗粒细胞进行体外培养,旨在探索梅花鹿颗粒细胞长期体外培养的条件,描述颗粒细胞的形态和表型特征,为进一步研究颗粒细胞的功能奠定基础。试验结果表明,梅花鹿卵巢颗粒细胞呈多角形或梭形,并伸出伪足,呈放射状生长,FSHR抗体鉴定结果为颗粒细胞纯度>90%。用含15%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养液培养,可获得生长活性好、细胞纯度高的梅花鹿卵巢颗粒细胞,HE染色和FSHR免疫荧光染色可以简便快速地鉴定梅花鹿卵巢颗粒细胞。     

猪卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定

为构建猪卵巢颗粒细胞的体外培养体系,研究毒素的生殖毒性奠定基础,采用机械分离法从1～5 mm的卵泡中提取猪卵巢颗粒细胞,苔盼蓝染色计算细胞存活率,Giemsa染色和结晶紫染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色方法检测促卵泡刺激素受体(FSHR)表达来鉴定颗粒细胞,MTT方法测定细胞生长曲线.结果显示分离提取的猪卵巢颗粒细胞存活率为65%左右,细胞纯度＞97%,细胞结构完整,边缘分明,胞核呈卵圆形位于靠近胞质的中央.另外细胞生长曲线表明,细胞从24 h开始进入对数生长期,并于96 h达到最高密度,之后进入平台期.分离培养的颗粒细胞生长状态良好,且细胞纯度＞97%,是理想的适合进行毒素生殖毒理学的细胞培养体系.     

颗粒细胞对卵泡发育的影响

卵泡发育是一个复杂的生理过程,通过间隙连接,颗粒细胞在卵母细胞的生长发育过程中起营养作用,并促进卵母细胞的成熟;颗粒细胞和膜细胞的相互作用是卵泡发育和维持正常功能的重要条件。作为卵泡发育的标志,颗粒细胞的生长分化是原始卵泡启动和生长的关键,并通过受体介导途径调控生长期卵泡的发育及卵泡闭锁,从而在卵泡发育过程中起重要的调控作用。     

G蛋白偶联雌激素受体在猪不同大小卵泡的分布与表达

为探讨G蛋白偶联雌激素受体(GPER)在猪不同大小卵泡的分布与表达,分离直径小于3 mm、3～5 mm及大于5 mm健康完整有腔卵泡,分别采用免疫组化、蛋白免疫印迹及免疫荧光结合共聚焦成像等方法,对各组卵泡中GPER的分布及相对表达进行研究。结果表明,GPER在猪不同大小卵泡的颗粒细胞、膜细胞、卵丘细胞和卵母细胞质膜及胞质中均有分布,以大于5 mm卵泡组颗粒细胞分布最多、着色最深;GPER相对表达量随着卵泡的发育而逐渐升高。GPER在猪不同大小卵泡的分布和表达量变化与卵泡的发育过程大体一致,提示其可能介导了雌激素调节猪卵泡发育与卵母细胞成熟的过程。     

microRNA对哺乳动物卵泡发育的影响

卵巢是动态变化的实质性器官,一个发情周期内卵巢上的卵泡始终经历着募集、选择、优势化等生理过程。卵母细胞以及外周的颗粒细胞和膜细胞共同组成卵巢上功能性单位—卵泡,卵泡发育受卵泡生殖细胞和体细胞间内分泌、自分泌、旁分泌的共同调控。microRNA (miRNA)是一种重要的转录后调控方式,通过与靶基因的3'-UTR结合转录后抑制或降解靶基因的方式,在调控动物卵巢卵泡的发生、发育、颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素合成分泌等方面发挥重要作用。本文主要对miRNA在哺乳动物卵泡发育中的最新研究进展,包括miRNA对卵泡发育、颗粒细胞、膜细胞功能的影响及其在卵巢上的表达分析等进行综述。通过了解miRNA在卵泡发育中的作用,为进一步解析哺乳动物繁殖性状调控的分子机制奠定基础。     

IFN-γ在胚泡植入期大鼠卵巢的分布

为研究IFN-γ对妊娠的免疫调控机制,本文采用免疫组化SP法,对大鼠胚泡植入期卵巢组织内IFN-γ的分布进行了研究。结果表明,IFN-γ在不同发育阶段卵泡的颗粒细胞中均有分布,原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡的卵母细胞呈中等阳性反应,在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡的卵泡内膜细胞呈IFN-γ强阳性反应,成熟卵泡内膜细胞则呈弱阳性反应;在卵巢组织基质细胞、血管内皮细胞、粒性黄体细胞、生殖上皮也出现强阳性反应,卵泡液呈阳性着色。结果表明,妊娠有机体生理剂量的IFN-γ通过影响卵巢功能参与了胚泡的植入,与妊娠的建立和维持密切相关。     

瘦素及其长型瘦素受体在雌性小鼠体内的表达

采用免疫组织化学SP染色法对长型瘦素受体在雌性小鼠生殖周期不同阶段的下丘脑、卵巢、子宫中细胞定位和分布进行了研究,并用ELISA方法对小鼠血清中的瘦素浓度进行了检测。结果显示,下丘脑神经元胞质中有棕褐色阳性颗粒,且阳性细胞数量随妊娠日龄增加逐渐增加,妊娠期与间情期阳性细胞数差异显著(P0.05);在卵巢中,卵母细胞胞质中有长型瘦素受体表达,随卵泡的发育,卵泡细胞中免疫反应阳性细胞数量逐渐增加;在胚泡附植期,瘦素受体在子宫腺和子宫内膜上皮细胞中大量表达。妊娠期血清瘦素浓度均高于间情期,且瘦素浓度从间情期到妊娠4日龄,呈上升趋势,妊娠5日龄稍下降,后随妊娠日龄逐渐增加。结果表明,瘦素及其长型受体能够促进卵泡发育,有利于小鼠胚泡的附植。     

山羊FST慢病毒载体构建及其对卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

研究卵泡抑素(FST)对山羊卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响。采集山羊卵巢组织、分离培养原代卵巢卵泡颗粒细胞,RT-PCR克隆山羊FST,设计shRNA片段,构建慢病毒过表达载体和干扰载体,感染原代卵巢卵泡颗粒细胞,qPCR技术检测过表达与干扰的效果, CCK-8检测细胞的增殖效果。结果显示:分离培养的山羊卵巢卵泡颗粒细胞经促卵泡素受体(FSHR)免疫荧光鉴定,阳性率为95%;慢病毒感染颗粒细胞时荧光蛋白的表达占比80%;qPCR验证FST过表达和干扰慢病毒载体的效果均显著(P0.05);过表达FST显著(P0.05)抑制卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,干扰FST显著(P0.05)促进卵巢卵泡颗粒细胞增殖。笔者分离出山羊卵巢卵泡颗粒细胞,成功构建FST过表达和干扰两种慢病毒载体,感染结果表明FST能够抑制山羊卵巢卵泡颗粒细胞的增殖,为进一步研究FST在哺乳动物卵泡发育调控中的作用及其机制提供了基础资料。     

ER免疫反应产物在幼龄公山羊下丘脑-垂体-性腺轴的表达

应用免疫组化SP法时雌激素受体(ER)免疫反应产物在幼龄公山羊下丘脑、垂体、性腺中的分布特点进行了研究。结果显示，下丘脑中ER免疫反应阳性神经元主要分布在视上核、室旁核、室周核等9个核团，在视前区、下丘脑外侧区等核团也有一定数量的阳性神经元；阳性细胞呈圆形、卵圆形、三角形不等，阳性物质大多位于细胞质和胞核，阳性纤维散布于各阳性核团中；在正中隆起和第三脑室室管膜可见大量小而密集排列的深染的阳性神经元。神经垂体中可见大小不等、排列较均匀且染色较深的纤维，腺垂体中腺细胞呈强阳性着色。睾丸曲细精管中的初级精母细胞和支持细胞以及睾丸间质细胞中的ER阳性产物均为微弱表达。由此表明，幼龄公山羊雌激素除作用于性腺外，还主要作用于中枢神经系统的广泛区域，推测其参与了脑中生殖、内分泌、认知等多种功能的调控。     

雌激素受体和雌性生殖研究进展

雌激素通过雌激素受体（ER）在雌性生殖活动中起着重要作用,雌激素受体是配体依赖的转录调节因子,属核受体超家族成员。目前认为存在2种亚型：即经典的ERα和新发现的ERβ。利用基因敲除技术研究表明,ERα和ERβ对于卵巢的发育不是必需的,但ERα可通过负反馈回路调节排卵,而ERβ通过卵巢内和卵巢外2条途径调节卵泡的发育和排卵,两者共同作用以维持雌性性征、卵泡发育和排卵等生理活动;在子宫中,ERα占主导作用,在子宫成熟和胚胎附植过程中起着重要作用,ERβ则能以反应特异性和剂量依赖性的方式调节ERα的作用。     

小梅山猪发情周期生殖器官雌激素受体α mRNA定位与相对定量研究

采用地高辛标记探针的原位杂交法(In situhybridization histochemistry,ISHH)测定小梅山猪发情周期第2、7、12、17天卵巢、子宫内雌激素受体α(Estrogen receptorα,ERα)mRNA的细胞定位与相对表达丰度。结果表明,卵巢中ERαmRNA杂交信号出现在各级卵泡的颗粒细胞,黄体早期部分细胞也有ERα基因微弱表达,卵母细胞未见有阳性染色存在。整个发情周期中卵巢ERαmRNA均呈低水平表达,但在发情周期第17天有上升的趋势。子宫中阳性颗粒主要出现在子宫内膜上皮腺体细胞中,基质部分很少。子宫内膜ERαmRNA丰度在发情周期第17天极显著高于发情周期第12天(P<0.01)。放射免疫测定发情周期第2、7、12、17天血浆E2水平,与子宫内膜ERαmRNA呈现同步性变化,两者显著相关(r=0.918)。     

褪黑素对雌性动物繁殖影响的研究进展

<正>卵母细胞和颗粒细胞是构成哺乳动物卵泡的主要细胞类型。排卵后,成熟卵母细胞经受精进入胚胎发育阶段并通过植入子宫与母体建立联系,而颗粒细胞则继续留在卵巢内与卵泡膜细胞一起分化形成黄体。因此,卵母细胞成熟、黄体形成、胚胎发育与胚胎附植是家畜繁殖学研究的核心内容。褪     

雌激素及其受体调控卵母细胞成熟的研究进展

目前很多女性受到不孕不育、自然流产和出生缺陷等诸多生殖相关疾病的困扰,其主要原因为生殖细胞减数分裂异常和卵母细胞质量下降。雌激素不仅参与调控哺乳动物的发情和性行为,也参与调控卵母细胞的生长发育。雌激素受体作为类固醇激素受体的一种,在介导雌激素发挥基因组效应和非基因组效应中有着重要的作用。目前关于雌激素受体调控卵母细胞成熟的报道多集中于硬骨鱼类,特别是新型膜受体GPR30,而在哺乳动物方面的研究鲜有报道。因此作者介绍了雌激素核受体ERα、ERβ与新型膜受体GPR30的结构与分布,简述了膜受体GPR30的不同类型配体的研究进展,综述了雌激素受体在调控卵母细胞发育中的相互作用,发现雌激素的核受体与膜受体在卵母细胞成熟的过程中可能发挥不同的调控作用,并进一步阐述了雌激素及其受体在卵母细胞成熟过程中的潜在调控机制。     

miRNA调节卵泡颗粒细胞凋亡及其机制的研究进展

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码RNA,具有广泛的基因表达调控作用,可以在转录后水平通过影响靶基因来调控相应蛋白质的表达,进而调节细胞的生命活动。miRNA在哺乳动物卵泡颗粒细胞中表达,并调控颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞作为卵巢卵泡中数量最多的细胞群,在卵泡发育过程中起着至关重要的作用,不仅为卵母细胞提供营养物质,还调控其发育和成熟。颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,影响卵泡的数量和质量从而影响雌性动物的繁殖性能。颗粒细胞凋亡过程受多种因素的调控。文章简述了miRNA对卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用及其机制,其中包括miRNA通过调控激素分泌和细胞凋亡相关因子的表达进而调节颗粒细胞的凋亡,miRNA对颗粒细胞凋亡相关信号通路的影响,miRNA调控颗粒细胞凋亡导致的卵巢相关疾病,并总结了对颗粒细胞凋亡有调控作用的miRNA,以及miRNA在疾病诊断和治疗中的潜在作用,以期为后续相关卵巢疾病的发病机制和治疗方案研究,以及提高雌性哺乳动物生殖性能提供指导和参考。     

胎牛卵巢组织学结构研究

获体长8～15cm黑白花奶牛雌性胎犊5头,用光镜和电镜对其卵巢的组织结构进行了观察.生殖上皮呈单层或复层住状,其增殖能力极强,细胞突破基膜进入卵巢深部,与卵巢间质细胞相混.在光镜下,卵原细胞在卵巢的外区,分为由卵巢间质包围成大包囊状共质体、合胞体状细胞群和小包囊细胞簇以及密集裸露的卵母细胞,它们可明显地分出明暗两类.卵巢间质细胞核具有两种形态:一种为长梭形,数量较多;一种为纺锤形,数量较少,常见具纺锤形核的细胞包围的卵母细胞,而形成典泡.常见1～3个卵泡上皮细胞包围的卵母细胞形成原始卵泡;另一种是极性分布成帽状包围的卵母细胞卵泡.电镜下观察,有具共质体状结构和膜相隔的卵原细胞群两种情况.共质体状卵原细胞内的细胞器位于核旁;有膜相隔的卵原细胞核大,胞质少,胞质中膜泡结构明显.     

前列腺素D2对山羊黄体细胞内分泌功能及其凋亡相关基因表达的影响

旨在研究前列腺素家族中生殖领域鲜有报道的PGD₂成员对单一环境下黄体细胞内分泌功能及其凋亡相关基因表达的影响，并解析其在黄体退化中的作用机理，为全面探析前列腺素家族成员的生物学作用提供新的理论依据。采集空怀母山羊黄体中期的卵巢组织，通过胶原酶II消化和胰酶差速离心法分离纯化以获得山羊黄体细胞。采用DMEM/F12进行离体培养，观察不同离体培养时间的黄体细胞生长状态；采用免疫组化法和细胞形态特征鉴定黄体细胞，将PGD₂设置三个不同梯度确定其对黄体细胞作用效果的剂量依赖性关系。最后，通过PGD₂最佳依赖性剂量处理黄体细胞，利用ELISA法检测黄体细胞的内分泌功能变化，流式细胞术测定黄体细胞的凋亡率及qRT-PCR/Western blot法检测凋亡相关基因mRNA/蛋白表达水平。结果显示，经突触素(synaptophysin, SYP)特异性表达蛋白鉴定，成功分离并获得了山羊原代黄体细胞。细胞形态实时观察和ELISA检测结果显示，离体培养5 d时黄体细胞胞质饱满、外形紧凑、形态清晰可见，并且黄体细胞的内分泌P₄