植物安全转基因技术研究现状与展望

转基因技术是进行基因功能研究和作物遗传改良的重要工具。根癌农杆菌介导转化法和基因枪轰击法是两种主要的遗传转化方法。从1996年首例转基因作物商业化种植以来,2012年全球有28个国家和地区种植转基因作物,种植面积已达1.7亿公顷。随着全球转基因作物的大面积商业化种植,转基因植物的安全性越来越多地受到公众关注。安全转基因技术的研发对于转基因植物的商业化生产具有重要意义。文章详细介绍了目前已报道的安全转基因技术原理及其应用现状。按其作用原理和目的将其分为4类：安全选择标记、标记基因删除及基因叠加、基因漂移防控法和基因定点编辑整合技术。其中,安全选择标记按其筛选原理分为糖代谢相关标记、氨基酸代谢相关标记、激素相关标记和抗逆相关标记。与抗生素和除草剂抗性标记相比,这类标记基因及其表达产物对人和其他生物更安全。标记基因删除及基因叠加技术包括共转化法、位点特异性重组法、转座子法、同源重组法以及基于位点特异性重组的基因叠加技术,其中共转化法又包括农杆菌介导的共转化法和基因枪介导的表达盒共转化法。基因叠加技术为复合性状转基因植物研发奠定了基础,有望成为未来多性状转基因植物研发的重要技术之一。基因漂流防控法包括叶绿体转化法和基因拆分法。基因定点编辑和整合技术包括锌指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9系统介导的基因定点编辑和整合技术。其中,TALEN和CRISPR/Cas9技术,设计简单,成本低,易操作,靶点分布广泛,有望成为安全转基因研发和应用的重要技术。文章对这些技术原理及其应用现状进行了综述,讨论了其优缺点,并展望了安全转基因技术研发重点和发展趋势。     

Cre／loxp位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

位点特异性重组系统能够在植物遗传转化中更准确、可靠的操纵外源DNA的引入或删除,已成为植物遗传操作中的重要工具。本文简要介绍目前应用最为广泛的Cre/loxp位点特异性重组系统的重组机制,并着重阐述Cre/loxp系统在删除转基因植物中标记基因及定点整合等方面的应用。     

转基因作物的安全标记基因

综述了转基因作物的安全标记基因及其对转基因作物的安全性。如磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)、木糖异构酶基因(xylA)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、谷氨酸-1-半醛转氨酶基因(hemL)、甜菜碱乙醛脱氢酶(BADH)基因、天门冬氨酸激酶(AK)基因等。     

无选择标记的植物转基因方法研究技术进展

植物遗传转化中,标记基因起着非常重要的作用。目前使用的抗性标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因,其引发的转基因植物安全性问题越来越受重视。笔者综述了近年来发展的各种无选择标记转基因植物方法及其在转基因植物中的应用,主要有共转化法、位点特异性重组系统、转座子系统、同源重组法和多元自主转化载体系统。通过评述各种方法的优缺点,以期推动安全型转基因植物培育和转基因植物产业化进程。     

论转基因技术与家蚕新品种的选育

介绍了家蚕转基因方法、国内家蚕品种选育的现状及国内外转基因家蚕品种选育进展,并指出转基因技术是家蚕品种选育的重要途径。     

无选择标记转基因植物研究进展

综述了近年来国内外在植物无选择标记转基因技术方面的发展和研究成果,包括共转化法、转座子法（Ac／Ds转座子系统）、位点特异性重组系统法（FLP/FRT、Cre／LoxP、R／RS）等。     

无选择标记的转基因家畜制备技术

选择标记基因(Selectable marker genes,SMGs)为目前应用体细胞核移植技术制备转基因家畜所必须.然而一旦完成筛选得到所需要的转化细胞或完成转基因动物的构建之后,SMGs就变成不需要的或多余的,而且这些带有标记基因的家畜还存在安全方面的隐患.因此,建立无选择标记的转基因家畜技术势在必行.目前能够采取的策略一是在筛选转化细胞或构建成功目的基因表达的家畜之后,删除SMGs;二是使用无筛选标记的转基因技术.综述了应用Cre/LoxP位点特异性重组系统删除SMGs的各种方法,以及应用锌指核酸酶(ZFNs)、TALEN和CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术,基于受精卵显微注射的无筛选标记转基因技术的研究进展,分析对于制备无SMGs的转基因家畜而言后者的优势所在,旨在为转基因家畜研究提供参考.     

当今转基因再生植物和转基因技术的研究进展

随着转基因植物研究的发展,转基因再生植物的名单越来越长,用传统的方法难以获得或不可能获得的、奇特的转基因再生植物被创造出来.转基因再生植物研究的迅速发展不仅展现了植物基因工程的成就,而且也展现了转基因再生植物的使用价值,因此,转基因再生植物不仅引起有关科学家的关心,也引起了其他各界的关注,因为植物在生物圈中是不可缺少的,与人类和饲养动物的生存关系极为密切.在这篇综述中,作者向关心转基因植物的人们精练地提供有关转基因再生植物和转基因技术研究进展的信息.     

剔除转基因植物中选择标记的研究进展

目前无选择标记技术已经成为基因工程中安全转基因研究方面的一个重要内容,转基因植物中标记基因的去除,一方面有利于消除公众对转基因的恐惧心理,另一方面有利于科学家向已转化植物中重复转入外源目标基因。文章对近几年出现的几种无选择标记技术作一综述,并对该技术的发展进行了展望。     

转基因技术改良家畜的现状与趋势

2006年8月,全球第一个通过乳腺生物反应器生产的药物ATryn批准上市,这标志着转基因技术在动物农业和生物医药产业的发展进入到一个新的黄金时期.作者从转基因技术的发展状况入手,综述了国内外利用转基因技术应用于改良家畜的研究历史、现状和产业化进展.动物克隆技术的发展不仅极大提高了转基因效率,同时还为家畜基因敲除和定点整合提供了新的途径;转基因动物在药物生产、疾病模型、干细胞治疗和异种器官移植等方向研发速度正在加快;近年来,在转基因动物育种领域,肉质、生长速度等重要生产性状的转基因改良也取得了突破.另一方面,国际上对转基因动物研究及其利用的生物安全性评估也日臻完善.显然,转基因动物产业正在初露端倪,其必将对人类社会发展产生重要的影响.     

家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析

【目的】探讨家蚕NF-kB类转录因子BmRelish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当BmNPV感染家蚕BmE细胞后BmRelish全长形式（BmRelish-FL）是否转变成其活性形式（BmRelish_act）;利用荧光定量PCR检测过表达BmRelish_act的细胞在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的BmNPV（BmNPV-EGFP）感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达BmRelish_act的细胞相比较,以确定BmRelish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达BmRelish_act的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达BmRelish_act的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】BmE细胞被BmNPV感染后,部分BmRelish-FL转变成其活性形式BmRelish_act;过表达BmRelish_act的细胞被BmNPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 kD超滤管超滤过表达BmRelish_act的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9-45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均＞3 kD,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】BmNPV感染导致BmRelish的激活;活化的BmRelish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量＜3 kD的多肽。     

家蚕BmYki-1基因鉴定与表达特征

【目的】Hippo信号通路中的核心激酶通过磷酸化作用于转录共激活因子Yki来调控下游基因的表达,在控制器官大小、细胞增殖与凋亡等方面起关键作用。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目模式昆虫,对其Hippo通路研究较少。论文旨在通过鉴定家蚕BmYki-1并对其序列信息和表达特征进行分析,为进一步研究中肠中Hippo信号通路提供基础,更好地了解Hippo信号通路在肠道稳态维持及组织损伤修复方面的调控机制。【方法】利用NCBI数据库及家蚕基因组数据库等相关信息,以哺乳动物和果蝇的Yki蛋白序列为依据,对家蚕Yki基因的同源序列进行鉴定;以家蚕大造品系为研究材料,利用PCR和cDNA末端快速克隆技术克隆获得家蚕BmYki两种可变剪切体的全长序列BmYki-1和BmYki-2,并基于生物信息学方法对两种剪切体的基因序列特征及蛋白结构特征进行分析;重点对BmYki-1在家蚕中肠组织中的功能进行探索;利用半定量PCR检测家蚕L5D3不同组织及中肠各个龄期BmYki-1表达情况;构建BmYki-1过表达载体并转染家蚕胚胎细胞系对其进行亚细胞定位分析;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达情况。【结果】家蚕中存在两种可变剪切形式的BmYki,分别为BmYki-1和BmYki-2,在家蚕基因组数据库中对应的注释号分别为BGIBMGA0082-TA和BGIBMGA0081-TA,其开放阅读框(ORF)分别为1 329和1 227 bp,分别编码442和408个氨基酸,其蛋白质分子量分别为48和44.1 kD,等电点分别为5.18和5.50,在139-171、220-252氨基酸处均各有1个WW结构域。多物种进化树表明,家蚕BmYki-1与同为鳞翅目的昆虫脐橙螟的亲缘关系最近,与鞘翅目、膜翅目昆虫较近,与双翅目昆虫较远,而与脊椎动物的亲缘关系最远。结果显示BmYki-1在家蚕中肠和丝腺中特异表达,中肠不同龄期表达谱分析结构显示表达量从2眠开始上调,在5龄的前中期表达水平较高。亚细胞定位试验表明BmYki-1蛋白在家蚕胚胎细胞系中主要存在于细胞核中,但在细胞质中也有分布。与对照相比,用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达量显著上调。【结论】获得了BmYki-1全长序列及时空表达特征,亚细胞定位BmYki-1蛋白主要在细胞核中,推测其在家蚕中肠细胞生长发育及损伤修复中起重要作用。     

家蚕表皮蛋白BmCPAP3-G的表达特征及其与几丁质的结合特性

【目的】探讨家蚕(Bombyx mori)表皮蛋白BmCPAP3-G的表达特征及与几丁质的结合方式,为家蚕表皮蛋白的功能研究提供依据。【方法】应用生物信息学方法分析家蚕CPAP家族表皮蛋白及BmCPAP3-G的结构域的序列特征;利用原核表达的方法表达BmCPAP3-G的融合蛋白,通过镍柱亲和层析技术纯化可溶性蛋白,利用5800 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定正确后进行多克隆抗体制备,并利用几丁质亲和层析技术验证BmCPAP3-G与几丁质的结合;利用半定量RT-PCR和Western blot方法对BmCPAP3-G的组织和时期表达情况进行检测;利用几丁质亲和层析技术探讨体外BmCPAP3-G的结构域与几丁质结合能力强弱的关系。【结果】BmCPAP3-G蛋白具有18个氨基酸组成的信号肽,分子量为27 k D,等电点为4.82,位于第15号染色体上,由3个相同的Cht BD2结构域组成,并且其结构域中的半胱氨酸和芳香族氨基酸的同源性较高;对BmCPAP3-G进行了克隆和原核表达,并利用镍柱亲和层析技术纯化到了较纯的可溶性蛋白,经5800 MALDI-TOF/TOF鉴定正确后制备了其多克隆抗体,通过几丁质亲和层析技术验证了BmCPAP3-G能够与几丁质进行结合;利用半定量RT-PCR和Western blot的方法对BmCPAP3-G的组织和时期表达情况进行检测,发现转录水平和蛋白水平的结果一致,BmCPAP3-G在头和表皮中的表达量较高,在中肠、生殖腺和丝腺中的表达量较低,从表皮和丝腺的时期表达情况分析BmCPAP3-G在4龄眠期的表达量最高,随着5龄期的进行表达量呈逐渐下降的趋势;为了探讨BmCPAP3-G结构域与几丁质结合的关系,对该蛋白的结构域进行原核表达及镍柱亲和层析纯化,成功纯化了有活性的结构域3、结构域1-2、结构域2-3,将这3个结构域进行几丁质亲和层析验证其与几丁质的结合能力,发现它们均能够与几丁质进行结合,但是结合能力有差异,结构域3相比于结构域1-2和结构域2-3的结合能力要弱,即两个结构域比单个结构域与几丁质的结合能力强。【结论】BmCPAP3-G为典型的CPAP家族的表皮蛋白,可能参与几丁质层在眠期的降解再形成过程。BmCPAP3-G单个Cht BD2结构域就能够与几丁质结合,但多个结构域的同时存在加强了其与几丁质的结合能力。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒系统超量表达家蚕let-7簇microRNAs

【目的】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统超量表达家蚕（Bombyx mori）let-7 簇（cluster）microRNAs：bmo-let-7、bmo-miR-100和bmo-miR-2795,为研究家蚕microRNA的功能提供参考。【方法】克隆家蚕let-7 miRNA簇（bmo-let-7 cluster,bmo-let-7-C）上各miRNA前体(pri-let-7、pri-miR-100与pri-miR-2795)和bmo-let-7-C全长序列,以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)基因为报告基因,昆虫细胞表达载体pFastBac1为穿梭载体,通过Tn7转座子把目的基因和报告基因转座到杆状病毒A. californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV)基因组上,获得各重组杆状病毒质粒（recombinant baculovirus plasmid,rBacmid）：Bac-let-7、Bac-miR-100、Bac-miR-2795和Bac-let-7-C。将重组Bacmid转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞系Sf9,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测miRNAs的表达。对转染的Sf9细胞进行、离心、收集上清液,获得具感染力的重组病毒,用于侵染新培养的Sf9细胞和注射家蚕幼虫个体,72 h后用荧光显微镜检查红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测miRNAs的表达。【结果】成功将bmo-let-7-C上各miRNA前体和bmo-let-7-C全长序列构建到杆状病毒基因组上,获得了各miRNA及bmo-let-7-C的过量表达载体。将各重组过量表达载体分别转染草地贪夜蛾细胞系Sf9,72 h后在显微镜下观察到了红色荧光蛋白信号,荧光定量PCR检测结果表明各miRNA显著过量表达;通过离心收集的各miRNA重组过量表达病毒粒子感染新培养的Sf9细胞72 h后检测到了更强的红色荧光蛋白信号,定量PCR结果表明各miRNA均显著过量表达。将各miRNA的重组病毒注射到家蚕5龄1 d幼虫体内后,均能显著超量表达相应miRNA,但注射Bac-let-7-C后只有miR-2795显著过量表达,并有明显的组织差异性,在丝腺中没有过量表达,在脂肪体、血液和中肠中显著过量表达。【结论】利用杆状病毒过量表达系统在草地贪夜蛾细胞系Sf9和家蚕个体中超量表达了家蚕let-7簇miRNAs,为研究家蚕let-7簇和其他miRNAs的产生机制和功能提供了参考。     

家蚕microRNA 7靶基因Bmhairy的鉴定和转录表达模式

【目的】microRNA是一类长约22个碱基的非编码RNA,通过与其靶基因的特异性结合来调控新陈代谢和生长发育等多种生命活动。鉴定家蚕(Bombyx mori)Bmhairy,比较Bmhairy和bmo-miR-7的表达模式,验证Bmhairy是否为bmo-miR-7的靶基因,为研究家蚕的变态发育机制提供线索。【方法】 用家蚕胚胎反转期的总RNA反转录合成的cDNA模板,克隆Bmhairy编码区（coding DNA sequence,CDS）和3′端非翻译区（3′ untranslated region,3′UTR）并进行序列分析。基于荧光定量PCR和芯片数据比较bmo-miR-7和Bmhairy的表达模式。利用RNAhybrid和MiRTif,预测和分析Bmhairy的mRNA 3′UTR上bmo-miR-7的靶位点。构建荧光素酶报告基因载体,用家蚕胚胎细胞系（BmE）进行共转染试验,验证bmo-miR-7对Bmhairy的3′UTR结合位点。【结果】 在家蚕中克隆了Bmhairy,含2个内含子和3个外显子,CDS长654 bp,编码217个氨基酸。Bmhairy的mRNA 3′UTR长366 nt。Bmhairy高度保守,含有bHLH、ORANGE和WRPW结构域。Bmhairy与鳞翅目（Lepidoptera）蛱蝶科（Nymphalidae）中的黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）相似度最高。Bmo-miR-7在家蚕胚胎期高量表达,在5龄第3天的精巢中相对较高,而Bmhairy在成虫期的表达量最高,在5龄第3天的头部相对较高。Bmhairy mRNA 3′UTR上有bmo-miR-7一个靶位点。共转染试验表明,bmo-miR-7下调Bmhairy。【结论】Bmhairy的家蚕时期表达和5龄第3天组织表达均与bmo-miR-7的表达呈相反的模式。靶基因预测和双荧光素酶转染试验表明Bmhairy是bmo-miR-7的靶基因,为进一步研究bmo-miR-7和Bmhairy在家蚕体内的生物学功能及调控关系提供了依据。     

家蚕脱胶蚕丝的蛋白组成成分

【目的】探讨家蚕（Bombyx mori）蚕丝纤维脱胶后蛋白质成分的变化,为了解丝蛋白在蚕丝纤维中的分布特征打下基础,并为改进蚕丝纤维加工工艺提供依据。【方法】利用木瓜蛋白酶、碳酸钠、尿素、中性皂和碱水法5种方法对蚕茧进行脱胶处理;并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同方法处理的蚕丝和不同蚕丝加工产品的脱胶程度,以及脱胶对丝素的影响;利用FASP酶解法和液相色谱-串联质谱联用的技术鉴定不同方法脱胶后的蚕丝及各种蚕丝加工产品的蛋白组分;利用生物信息学的方法对鉴定到的丝蛋白进行注释并通过非标定量的方法比较各种样品中丝蛋白的丰度。【结果】通过5种方法对蚕茧丝进行脱胶,蛋白电泳检测发现木瓜蛋白酶法降解丝胶蛋白的同时基本不会破坏丝素蛋白;碳酸钠法对丝胶的降解能力较弱,但对丝素的降解较强;中性皂法和尿素法对丝胶蛋白和丝素蛋白的降解都比较严重;碱水法的效果不理想。通过蛋白质组学研究发现木瓜蛋白酶和中性皂法脱胶后的蚕丝中几乎没有丝胶蛋白,主要是丝素蛋白、seroin 1和甘氨酸富含蛋白等;尿素法和碳酸钠法脱胶后的蚕丝中残留蛋白最少,主要是丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白等。通过蛋白电泳检测了6种蚕丝加工产品中的蛋白质,发现生丝和胚绸中的丝素蛋白比较完整,绸、缎和电力纺中的丝素蛋白出现了部分程度的降解,而丝绸旧衣中的丝素蛋白有严重的降解。通过蛋白质组学分析发现生丝和胚绸中的主要成分包括3种丝素、丝胶1、seroin 1、osiris 9a、甘氨酸富含蛋白和蛋白酶抑制剂SPI51等;绸、缎和电力纺的主要成分包括3种丝素蛋白和seroin 1,而丝绸旧衣中的主要成分包括3种丝素蛋白和甘氨酸富含蛋白。【结论】木瓜蛋白酶脱胶法能够最大程度地保持丝素纤维的完整性,碳酸钠和尿素法的脱胶程度最高。生丝和胚绸中的丝胶蛋白含量很高,丝素纤维比较完整。绸、缎和电力纺中的丝胶蛋白很少,丝素纤维有部分程度的降解。蚕丝经过彻底的脱胶后还剩余的蛋白包括丝素重链、丝素轻链、丝素p25、seroin 1和甘氨酸富含蛋白。     

家蚕组织蛋白酶O（BmCatO）基因鉴定及表达分析

【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）蛋白酶O基因Cathepsin O（BmCatO）,分析其mRNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长cDNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E. coil表达菌株Rosetta(DE3),经IPTG诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白,然后利用Ni+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化,最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上,scaffold为nscaf2943,基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式,剪切体1开放阅读框（ORF）全长为1 071 bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子量36 kD,等电点8.594;剪切体2 ORF全长为942 bp,编码313个氨基酸,预测蛋白分子量40 kD,等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成,剪切体2的第六外显子出现部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似,均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表明,无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类,且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟（Chilo suppressalis）组织蛋白酶O最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞,剪切体1的表达水平明显高于剪切体2,但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶O原核表达系统,利用亲和层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶O重组蛋白,并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA显示其效价高达到1﹕1 280 000。Western印迹结果表明,该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶O重组蛋白。【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整cDNA序列及表达特征,经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白,通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。     

家蚕丝腺生物反应器表达狂犬病病毒核蛋白

【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统,尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白（RVNP）的技术体系,为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列,采用家蚕丝胶蛋白基因（Ser1）启动子为特异性启动子,将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体（pBA3EGFP）中,并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个,蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中,Western blot分析表明RVNP蛋白可能附着于丝胶蛋白并随家蚕吐丝行为分泌到蚕茧中。【结论】获得了能够表达外源的RVNP蛋白的转基因家蚕品系,该系统有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。     

家蚕组织蛋白酶L(BmCathepsin L)基因鉴定、表达及其功能分析

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6.0软件进行同源比对并构建进化树。运用RT-PCR和qRT-PCR对其时空表达特征进行分析。选取该基因的特异性片段,经PCR扩增,测序验证后将其连接至pET-28载体,转化至Rosseta感受态表达菌株,经IPTG在适宜温度条件下诱导,获得组织蛋白酶L重组蛋白。然后再利用镍离子亲和层析法对该蛋白进行纯化,获得纯度较高的重组蛋白。最后利用大肠杆菌对家蚕血液系统进行攻毒,检测家蚕组织蛋白酶L基因的表达水平。【结果】通过查询家蚕基因组数据库和生物信息学分析得出,家蚕组织蛋白酶L基因定位于家蚕第10号染色体上,基因编号为BGIBMGA006893,nscaf2860。基因开放阅读框全长687 bp,编码228个氨基酸,含有保守的Pept_C1结构域。通过在线网站预测,得出该蛋白酶的分子量为26.132 k D,等电点为4.57。进化分析表明该基因与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾和黑脉金斑蝶亲缘关系最为接近。RT-PCR显示该基因集中表达于血细胞,在血液不同龄期也较高表达。用His抗体检测经纯化后的蛋白,最终成功孵育出纯化后的蛋白条带;大肠杆菌个体攻毒免疫试验检测显示,其mRNA表达水平随攻毒时间呈现抛物线式的显著性变化规律,从而揭示出BmCat L与家蚕免疫系统的关联性。【结论】克隆获得家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA序列,发现其特异性高表达于血细胞。通过原核表达和蛋白纯化成功获得了该基因的重组蛋白。大肠杆菌的刺激能够显著上调其表达,推测组织蛋白酶L可能参与家蚕免疫反应。