香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立

【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术综述

CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现,是适应性免疫系统的一部分,现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达.同时,CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制,确定药物开发的靶标,并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究.对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展...     

小麦Pinb基因启动子区CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经逐渐成熟并在多种植物中得到成功应用,促进了基因功能的研究。小麦籽粒硬度是决定小麦加工品质的重要性状,Pinb是控制籽粒硬度的关键基因之一。本研究以小麦Pinb基因为对象,联合采用常规PCR和Golden Gate cloning技术,构建了包含小麦Pinb基因启动子区双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。将重组载体转入小麦原生质体中进行sgRNA活性的检测,在两个靶点位置均发生了突变,编辑效率分别为4. 57%和4. 37%,基因编辑类型包括碱基替换和碱基缺失。该研究为在小麦中实现Pinb基因的定点突变奠定了基础,对其功能研究和小麦品质改良均具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9 技术定向编辑加工番茄 SlACS2

加工番茄为呼吸跃变型果实,伴随呼吸跃变产生大量乙烯,即系统Ⅱ乙烯,易使番茄果实过熟,腐烂变质。 SlACS2 是番茄系统Ⅱ乙烯合成的限速酶,旨在通过 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统修饰该基因,调控系统Ⅱ乙烯过量表达,以迟滞番茄过熟腐烂。利用 CRISPR/Cas9 系统定点编辑加工番茄 SlACS2基因,在 SlACS2的第2外显子区域设计 2个靶位点,构建双靶点的CRISPR/Cas9 敲除载体,通过农杆菌介导法转化加工番茄,再生培养获得T0代转基因幼苗,通过PCR 扩增卡那霉素抗性基因获得阳性株系。为进一步获得纯合突变,对T1代植株的双靶位点区域进行PCR 扩增和测序分析,鉴定 SlACS2突变类型。结果发现,从阳性植株的T1后代中鉴定出6种在两个靶位点发生纯合突变类型植株,其中靶位点1突变类型较为丰富,分别发生单碱基的插入及1个、4个、5个和9个碱基的缺失;靶位点2则只有7个碱基的缺失一种编辑类型。结果表明,已成功在加工番茄体内实现对内源 SlACS2的定点敲除,获得的基因编辑植株,为进一步筛选耐贮突变体提供材料基础。     

花椰菜高效CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的构建

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在许多农作物上成功应用,实现了许多重要农艺性状的精准改良.本研究参考甘蓝型油菜(Brassica napus L.)遗传转化体系,以花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis)育种材料'FQ-36'为受体,以花青素合成关键基因BoANS为目标基因,构建...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是近年发现的继ZFNs和TALENs两种基因编辑技术之后的一种新型基因组定点编辑技术。本研究分别从CRISPR/Cas9系统的结构、类别、作用机制、相关应用以及存在问题等方面进行综述,旨在为相关领域研究提供参考。     

利用CRISPR/Cas9系统编辑拟南芥ILR3基因及功能验证

拟南芥转录因子ILR3(IAA-Leucine Resistant 3)在铁稳态的调节、葡萄糖异硫氰酸盐(glucosinolate,简称GLS)的生物合成和病原体响应方面起到重要作用。为更深入探索该转录因子在植物体内的更多功能,利用YAO基因启动子驱动Cas9在拟南芥中表达,成功获得ILR3基因编辑突变体。测序结果及序列分析结果表明,在ILR3编辑拟南芥中,该基因编码区发生了碱基缺失或插入,导致蛋白ILR3保守结构域丢失。并且,这些基因编辑突变体T2代幼苗与T-DNA插入突变体ilr3-2在缺铁环境下表现出相同的性状,进一步验证ILR3转录因子在植物对铁的吸收及体内平衡的作用,也为深入研究其更多生物学功能奠定了工作基础。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及研究进展与应用

CRISPR/Cas系统是一种从细菌和古生菌中衍生而来的适应性免疫系统,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的"记忆",从而防止外来DNA片段的侵袭。CRISPR/Cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势已经成为改良作物的新一代基因组编辑技术。本文从CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术的发展与应用等方面综述其最新研究进展,并着重介绍该技术的关键影响因素,为相关研究者提供参考。     

基因编辑CRISPR/Cas9技术在农业领域的应用

CRISPR/Cas9系统通过靶向突变对植物基因组进行编辑,是研究基因功能和作物改良的第三代基因编辑工具。本文介绍了CRISPR/Cas9打靶系统基本结构、工作原理,并展示了其在作物基因功能研究和品质改良中的应用前景。     

CRISPR/Cas9技术编辑新疆甜瓜全缘叶基因

【目的】以新疆甜瓜地方品种老汉瓜为研究材料,对其全缘叶基因进行基因编辑,构建新疆甜瓜CRISPR/Cas9敲除载体,分析甜瓜耐受潮霉素最大浓度,为研究新疆甜瓜裂叶基因的功能奠定基础。【方法】在课题组前期确定甜瓜全缘叶基因PLL的基础上,结合甜瓜基因组数据,设计PLL基因外显子的特异靶位点,构建甜瓜全缘叶基因PLL的CRISPR/Cas9敲除载体,将构建好的载体转化到大肠杆菌中,并测序验证,然后对甜瓜耐受潮霉素浓度进行分析。【结果】针对全缘叶基因PLL外显子选择一个长约20 bp的靶位点,根据靶位点设计sgRNA框,并成功将其构建到CRISPR/Cas9敲除载体上,然后将载体成功转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜可耐受潮霉素的最大浓度为10 mg/L。【结论】成功获得甜瓜全缘叶基因PLL的敲除载体,并转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜耐受潮霉素的最大浓度,为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究新疆甜瓜裂叶基因pll的功能奠定基础。     

CRISPR/Cas9介导基因组编辑技术在植物基因中的研究进展

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术是在DNA双链的特定位置形成双链断裂,然后通过同源重组或非同源末端连接方式进行修复,造成基因组碱基局部缺失或插入而引起基因突变,它具有操作简单、突变效率高等优势。笔者归纳了CRISPR/Cas9系统的基本结构、分类及其在植物基因中的研究进展和未来的发展方向。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7...     

基于CRISPR/Cas9技术构建猪miR-136基因编辑载体

为了阐明microRNA对猪产仔数的调节机制,采用CRISPR/Cas9技术构建针对猪miR-136的基因编辑表达载体。通过实验,在miR-136基因成熟区及其下游设计两个单链引导RNA(sgRNA),合成4条磷酸化的单链DNA寡核苷酸,复性后形成两条带粘性末端的双链寡核苷酸片段,插入线性化的载体pX462的BpiI酶切位点处,转化感受态大肠杆菌DH5α,经测序确认,得到两个编辑表达载体pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。构建了两个编辑miR-136基因的表达载体,为猪繁殖力的调控研究奠定了技术基础。     

利用 CRISPR/Cas9 技术定向编辑水稻 OsIQD1 基因

【目的】植物特异性 IQD 家族蛋白质是一类植物特有的钙调素结合靶蛋白,在植物的生物防 御和发育调节中发挥重要作用。前期酵母双杂筛选试验表明,Pik-H4 与 OsIQD1 存在互作关系,为进一步 揭示 OsIQD1 在水稻抗稻瘟病中的生物学功能,利用 CRISPR/Cas9 编辑技术对 OsIQD1 基因进行定点编辑。 【方法】通过序列比对获得水稻 OsIQD1。在 OsIQD1 第 1 外显子和第 5 外显子（DUF4005 结构域）区域设计 2 个 20 bp 的编辑靶点,将 2 个靶点核苷酸片段克隆至 pRGEB32 载体,获得 pRGEB32-OsIQD1-gRNA 载体,利用 农杆菌介导法转化水稻 Pik-H4 NIL 愈伤组织,经再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对 T0 代转基 因植株靶点区域序列进行 PCR 和测序,分析 osiqd1 的突变类型。【结果】转基因再生植株经过对抗潮霉素基因 HPT Ⅱ的 PCR 鉴定,获得 30 株阳性株系。对 T0 代植株靶点附近序列的测序结果表明,OsIQD1 基因被成功编 辑,两个位点的编辑效率分别为 21.67% 和 26.67%,其中,靶点 2 区域有 1 个纯合突变株系。【结论】研究结 果为进一步利用 osiqd1 突变体开展其参与钙离子 / 钙调素信号转导通路的机制研究提供了遗传材料,初步推定 OsIQD1 参与植物的基础免疫反应。     

基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的水稻定向改良研究进展

水稻（Oryza sativa L.）是单子叶植物研究的模式作物,同时也是世界上最重要的粮食作物之一。我国是世界上最大的稻米生产国和消费国,水稻在保障粮食安全方面发挥着极其重要的作用。水稻品种的不断改良升级是保障稻米稳产增产的有效途径。以育种家经验为基础的传统育种方式的育种周期长、精准性差、可预见性低,已逐渐不能满足现代育种需求。CRISPR/Cas9 是继锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）等技术之后的新一代基因编辑技术,能在不改变受体遗传背景的前提下,精准、定向地改造控制重要性状的功能基因以达到性状快速升级改良的目的,已逐步成为动植物科学研究和作物育种的重要工具。目前CRISPR/Cas9 基因编辑技术已经广泛应用于水稻重要性状的定向改良和种质资源创新研究。综述了 CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理及其在水稻抗病性、品质、育性、非生物胁迫等方面的研究进展,并对 CRISPR/Cas9技术的发展和未来在水稻育种中的应用进行了展望,为未来 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在作物定向改良中的进一步利用提供参考。     

CRISPR/Cas9系统研究进展及应用

CRISPR/Cas9是目前应用广泛的基因组编辑工具,该系统利用一段RNA引导Cas9核酸酶可对多种细胞及动植物基因组实现特定位点的切割和修饰,具有操作简单、作用高效等优点。Ago是另一类核酸内切酶,具有良好的应用潜力。从CRISPR/Cas9的发展现状、结构基础、作用机制、改进后的基因编辑机制及基因编辑技术的应用等方面进行了综述,讨论其存在的问题,并提出相应对策。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

[目的]OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程.利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11 (ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻...