鲤鱼PLA2g3a1催化活性区的原核表达及酶活性分析

[目的]本文旨在获得可溶的鲤鱼(Cyprinus carpio)groupⅢ分泌型磷脂酶A_2(PLA2g3a1)催化活性区(PLA_2 bee venom like region,PBVR)原核重组蛋白,并测定该蛋白的磷脂酶活性。[方法]分别构建标签蛋白小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)、硫氧还原蛋白(thioredoxin A,TrxA)、N利用物质A(N-utilization substance A,NusA)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)与PBVR的重组表达质粒,转化入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)进行原核表达,比较不同标签蛋白的促溶作用;使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,与BSA蛋白标准品电泳比对确定纯化后蛋白的浓度;采用偶联氧脂合酶法测定PBVR重组蛋白的磷脂酶活性。[结果]促溶作用最高的标签蛋白是NusA,可溶性重组蛋白占总蛋白的95%,其次是MBP和TrxA,分别占87%和47%。综合考量可溶性重组蛋白的得率,选择MBP融合蛋白。重组原核表达蛋白MBP-PBVR的磷脂酶比活力[(13.68±0.12)U·μmol~(-1)]显著高于TrxA-PBVR[(0.94±0.01)U·μmol~(-1)]和NusA-PBVR[(0.93±0.04)U·μmol~(-1)](P0.05)。MBP-PBVR酶促反应最适pH值为7.5,在鲤鱼适宜生长温度(20～30℃)内酶活性无差异,微量Ca~(2+)即能显著提高MBP-PBVR的磷脂酶活性,K_d为0.0153 mmol·L~(-1);MBP-PBVR磷脂酶的米氏方程参数V_m为2.2μmol·L~(-1)·min~(-1),K_m为31.9μmol·L~(-1)。[结论]获得了可溶的具有磷脂酶活性的原核重组表达蛋白PBVR,揭示了MBP-PBVR磷脂酶活性特征。     

捻转血矛线虫GST耐药基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究捻转血矛线虫GST基因的原核表达及其生物信息学特征,以捻转血矛线虫cDNA为模板,设计特异性引物扩增GST基因,构建原核表达载体pET30a(+)-GST转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌进行表达条件优化后,再通过SDS-PAGE分析蛋白表达的特征,并利用在线软件对GST蛋白进行生物信息学分析。结果表明:捻转血矛线虫GST基因大小为618 bp;诱导后的pET30a(+)-GST重组菌最佳诱导条件为0.05 mmol/L的IPTG在37℃时诱导6 h,以包涵体的形式存在,大小约为29 ku。生物信息学分析表明:GST分子式为C_(1083)H_(1657)N_(277)O_(294)S_6,属于不含信号肽和跨膜区的亲水性蛋白;二级结构主要由α螺旋形成;潜在的抗原表位主要位于25～48、55～63、92～106、113～124、139～147、170～189和195～205位氨基酸附近。本试验成功构建GST基因原核表达系统,优化表达条件下能稳定纯化GST重组蛋白,为进一步探索捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制及GST蛋白的生物学特性提供研究基础。     

外源NADP~+和NADPH缓解番茄幼苗NaCl胁迫伤害的初步研究

采用营养液培法,以加工番茄品种‘里格尔87-5’为材料,通过对NaCl胁迫下加工番茄幼苗叶片分别喷施5、10、15μmol·L~(-1)NADP~+和NADPH,研究外源NADP~+、NADPH对NaCl胁迫下加工番茄幼苗生长及其抗逆生理指标的影响。结果表明:外源喷施NADP~+、NADPH均能改善NaCl处理下加工番茄幼苗的生长性状,增加叶片叶绿素含量,提高根系活力和叶片过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,降低丙二醛(MDA)质量摩尔浓度。通过不同处理综合指标总加权值比较评价得出:NaCl胁迫下喷施5μmol·L~(-1) NADPH的效果最佳,其次为10μmol·L~(-1)NADP~+。可见,外源喷施NADP~+、NADPH通过增加色素含量,可提高抗氧化酶活性,降低膜脂过氧化水平,在一定程度上缓解盐胁迫对植株的伤害,从而增强对盐胁迫的适应性。     

两种方法测定绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP21配体结合特性的结果比较

【目的】比较荧光竞争结合试验(fluorescence competitive binding assay)和微量热涌动(microscale thermophoresis,MST)技术在研究绿盲蝽(Apolygus lucorum)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)Aluc OBP21配体结合特性上的差异,探索一种新的测定昆虫OBPs结合功能的方法。【方法】提取绿盲蝽雌、雄成虫触角总RNA并进行反转录,获得绿盲蝽成虫触角c DNA。采用特异性克隆引物,以绿盲蝽成虫触角c DNA为模板进行PCR扩增,构建p ET32a/Aluc OBP21重组质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,获得含表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。通过高亲和Ni-NTA纯化介质对重组粗蛋白进行纯化,采用重组肠激酶切掉His-tag标签,最终获得无表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。利用荧光竞争结合试验,以1-N-phenylnaphthylamine(1-NPN)为荧光探针研究重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,其中1-NPN和气味标样均溶解在质谱纯级的甲醇中。同时,利用MST技术解析重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,候选配体标样溶解在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液中。候选配体化合物包括8种潜在的盲蝽性信息素及性信息素类似物、12种植物绿叶挥发物和绿盲蝽驱避剂主要组分二甲基二硫醚等。【结果】重组Aluc OBP21蛋白在上清液和包涵体均能够表达,最终选择上清组分进行目标蛋白纯化,利用重组肠激酶在22℃切除His-tag标签得到无标签的重组Aluc OBP21蛋白。荧光竞争结合试验结果显示,重组Aluc OBP21与荧光探针1-NPN的解离常数为(6.88±0.31)μmol·L~(-1),Aluc OBP21能够与β-紫罗兰酮和β-石竹烯结合,解离常数分别为(13.74±1.93)和(13.24±2.12)μmol·L~(-1),而其他候选配体均不能与重组Aluc OBP21有效结合。MST测试结果显示,Aluc OBP21可以与β-石竹烯、β-紫罗兰酮、β-蒎烯和柠檬烯有效结合,解离常数分别为(0.20±0.02)、(0.05±0.01)、(0.70±0.04)和(0.40±0.06)μmol·L~(-1)。其余候选配体化合物与Aluc OBP21的热涌动不能随配体浓度变化而表现有规律的变化,故这些气味化合物不能与Aluc OBP21发生结合作用。【结论】MST检测与荧光竞争结合试验相比,MST所得配体结合谱更广,不会遗漏一些结合力较弱的气味配体。     

捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析

根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果表明该基因获得了表达,重组融合蛋白相对分子质量大小约为60.3×103,主要以包涵体形式存在。Western blot分析显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。重组蛋白具有一定的酶活性,其最佳反应温度和pH值分别为30℃和7.5。结论:该重组蛋白表达成功并具有一定的抗原性和激酶活性。     

捻转血矛线虫精氨酸激酶基因的克隆与表达及酶活性分析

根据捻转血矛线虫精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因序列设计1对特异性引物进行RT-PCR,将得到的片段克隆到pMD19-T载体后进行序列测定和分析;将该基因的开放阅读框克隆到pET-32a(+)载体中,获得原核表达质粒pET32/AK并转化大肠杆菌BL21;重组子用IPTG诱导后用SDS-PAGE分析其表达情况;对重组蛋白变性、纯化后用梯度尿素对其进行连续透析复性,对复性后的重组蛋白用定磷法进行精氨酸激酶活性分析。结果表明从捻转血矛线虫总RNA中扩增出大小约为1 104 bp的DNA片段。该基因与GenBank中捻转血矛线虫AK基因的相似性为89%。SDS-PAGE电泳结果表明该基因获得了表达,重组融合蛋白相对分子质量大小约为60.3×103,主要以包涵体形式存在。Western blot分析显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。重组蛋白具有一定的酶活性,其最佳反应温度和pH值分别为30℃和7.5。结论:该重组蛋白表达成功并具有一定的抗原性和激酶活性。     

硫酸头孢喹肟乳房注入剂中有关物质的检测方法

【目的】参考硫酸头孢喹肟注射液兽药质量标准,建立了硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质的检测方法,建立专属性强、灵敏度高、快速简便的方法,可有效的分析硫酸头孢喹肟乳房注入剂的有关物质,为制剂的质量控制和工艺优化提供依据。【方法】仪器方法按照硫酸头孢喹肟注射液兽药质量标准要求,色谱条件:流动相为高氯酸钠缓冲溶液(精密称取NaClO_4·H_2O_3.45g于1 000 m L水溶解,加入磷酸12 m L,乙腈115 m L,三乙胺调pH3.6),流速为1 m L·min~(-1),检测波长为270 nm,进样量为20μL。采用高效液相色谱法(HPLC)峰面积归一化法计算硫酸头孢喹肟乳房注入剂(干乳期)中有关物质的检测限及其浓度;考察该检查方法精密度及仪器精密度;考察样品主成分及有关物质的稳定性及线性相关性;对样品以适当条件的破坏后对该方法进行专属性考察,例如使用0.2 mol·L~(-1) HCl溶液、0.2 mol·L~(-1) NaOH溶液对硫酸头孢喹肟乳房注入剂进行4 h的破坏;使用10%H_2O_2溶液对硫酸头孢喹肟乳房注入剂进行30 min的破坏;以及90℃高温对硫酸头孢喹肟乳房注入剂进行1 h的破坏。对比样品破坏前后主成分峰面积的降解程度,有关物质含量的变化程度,主成分峰与杂峰之间及有关物质峰与杂质峰之间的分离度,以及杂质峰个数的变化等主要参数。并对硫酸头孢喹肟乳房注入剂(干乳期)三批样品中的有关物质含量进行测定。【结果】硫酸头孢喹肟乳房注入剂经过一系列的梯度稀释后,当样品主成分浓度为7.5μg·m L~(-1)时,有关物质的信噪比≥3,按HPLC峰面积归一化法计算,有关物质浓度为0.05μg·m L~(-1);100μg·m L~(-1)浓度样品进样精密度RSD达到0.8%,方法精密度RSD达到0.6%;主成分在7.5—300μg·m L~(-1)浓度范围内,按HPLC峰面积归一化法计算,有关物质浓度范围为0.05—2μg·m L~(-1),有关物质浓度对峰面积线性回归分析方程为y=45935x-130.03,相关系数r=1。硫酸头孢喹肟乳房注入剂在一定时间内在强酸、强碱、氧化、高温破坏条件下均有降解,以破坏前样品主成分含量为100%计,使用10%H_2O_2溶液对制剂进行30 min的氧化破坏后主成分含量降解达30%左右,在90℃高温下对制剂进行1 h的高温破坏后主成分含量降解达20%左右,使用0.2 mol·L~(-1) HCl溶液和0.2 mol·L~(-1) NaOH溶液对制剂进行4 h的酸、碱破坏后主成分含量降解均在10%左右。破坏前后主成分峰与有关物质峰的保留时间均未发生变化,主峰与杂峰以及杂峰与杂峰之间分离度均大于1.5,杂质峰含量发生变化,杂质数量破坏后均有增加。对硫酸头孢喹肟乳房注入剂(干乳期)三批制剂有关物质含量进行检测后,按HPLC面积归一化法计算显示有关物质峰面积均未超过主峰峰面积的2%,符合兽药质量标准的规定。【结论】硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质检测方法简便易行,专属性强,灵敏度好,精密度高,可应用于硫酸头孢喹肟乳房注入剂有关物质的考察。     

外源一氧化氮对镉胁迫下紫花苜蓿幼苗活性氧代谢和镉积累的影响

采用外源一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)对镉(Cd)胁迫(0.5 mmol·L~(-1) CdCl_2)下紫花苜蓿(Medicogo sativa L.)幼苗进行预处理,分析NO对Cd胁迫下紫花苜蓿幼苗膜脂过氧化、抗氧化酶系统、渗透调节物质和Cd积累量的影响,探讨NO在植物逆境胁迫响应中的作用及其机理。结果表明:300μmol·L~(-1)SNP显著降低Cd胁迫下紫花苜蓿幼苗相对电导率(REC)、丙二醛(MDA)含量、过氧化氢(H_2O_2)含量和超氧阴离子(O_2~-·)产生速率;400μmol·L~(-1)SNP显著促进脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)、类胡萝卜素(Car)的合成;200μmol·L~(-1)SNP显著降低叶和茎中Cd含量;100μmol·L~(-1)SNP显著降低根中Cd含量。不同浓度SNP对紫花苜蓿叶、茎和根中抗氧化酶活性的影响比较复杂:100μmol·L~(-1)SNP显著增强叶中过氧化物酶(POD)活性、叶和茎中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性;50μmol·L~(-1)SNP显著增强叶、茎和根中抗坏血酸酶(APX)活性;400μmol·L~(-1)显著增强茎和根中POD活性。适当浓度的NO可以增加渗透调节物质含量和调节抗氧化酶活性,有效保护紫花苜蓿幼苗膜系统的稳定性,缓解Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗的伤害。     

蝗虫微孢子虫套式PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫(Paranosema locustae)的套式PCR方法,为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持。【方法】以GenBank数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位RNA为目的基因,采用PrimerSelect软件设计两对特异的套式PCR引物P.L.-F1/P.L.-R1和P.L.-F2/P.L.-R2,将微孢子虫液用0.2 mol·L~(-1) KOH处理后得到的发芽液作为模板进行PCR扩增,建立以P.L.-F1/P.L.-R1为外侧引物、P.L.-F2/P.L.-R2为内侧引物的套式PCR,扩增产为分别为298和242 bp。对引物浓度、退火温度及循环数进行优化,建立套式PCR方法,以此方法对梯度稀释的微孢子虫液进行灵敏性检测,并对采自哈密地区巴里坤北山的蝗虫样品进行检测。同时对提取的微孢子虫液进行传统的显微镜检测,并比较两种方法的灵敏度。【结果】建立了蝗虫微孢子虫的套式PCR快速特异性检测方法,优化后的PCR反应体系均为20μL:Buffer(10×)2.0μL,d NTPs(10 mmol·L~(-1))0.3μL,TaqDNA酶(250 U)0.3μL,上、下游引物(10μmol·L~(-1))各0.3μL,微孢子虫发芽液(第2轮以第1轮产物10×稀释液为模板)1μL,加水补充至20μL;PCR反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,第1轮60℃退火(第2轮62℃退火)30 s,72℃延伸20 s,共35个循环;72℃延伸10 min,10℃保存。灵敏度试验显示,检测的微孢子虫数量可以达到12.2个孢子/μL(DNA量为1.07 pg·μL~(-1))。应用建立的套式PCR方法,对采自新疆哈密地区巴里坤北山的240头蝗虫样品进行了微孢子虫检测,检测结果为23.3%的阳性,而显微镜检测结果阳性仅为3.8%。【结论】研究建立的套式PCR方法能够快速特异地检测蝗虫微孢子虫的感染,为蝗虫微孢子虫致病性研究及田间应用提供了技术支持。     

盐胁迫下内源NO对黄瓜幼苗活性氧代谢和光合特性的影响

【目的】探讨盐胁迫下黄瓜幼苗内源一氧化氮(NO)的生理生化调节机理及其调控途径,为揭示黄瓜的抗盐机理和生产应用提供参考。【方法】以黄瓜幼苗为研究对象,采用一氧化氮合成酶抑制剂(L-NAME,L-硝基精氨酸甲酯)、硝酸还原酶抑制剂(tungstate,钨酸钠)和一氧化氮清除剂(c PTIO,4-羧基苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物)处理盐胁迫下的黄瓜幼苗,研究处理对黄瓜幼苗叶片内源NO含量、活性氧代谢、光合参数和叶绿素荧光参数的影响。【结果】盐胁迫可诱导黄瓜幼苗叶片内源NO含量增加,采用200μmol·L~(-1) L-NAME、100μmol·L~(-1) tungstate和200μmol·L~(-1) c PTIO处理均抑制了盐胁迫下的黄瓜幼苗叶片中抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT))的活性,降低了游离脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白质的含量,增加了丙二醛(MDA)含量、超氧阴离子自由基(O_2·~-)产生速率和质膜透性,使细胞膜脂过氧化加剧,加重了盐胁迫对黄瓜幼苗的损伤。同时,气体交换参数Pn、Gs、Tr、Ci显著降低,叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSⅡ、q P降低,NPQ显著升高,导致叶片光合机构受损,叶片光合速率下降。【结论】在盐胁迫条件下,内源NO的变化可能直接调节了黄瓜幼苗的抗氧化能力,有效地缓解了脂膜过氧化伤害和对叶片光合机构的损伤,且黄瓜幼苗的活性氧代谢和光合特性主要通过一氧化氮合酶途径调控。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

茶尺蠖信息素结合蛋白PBP2的基因克隆、原核表达及其结合功能

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)进行全长cDNA序列克隆(Gen Bank登录号为KX421383)后,将该基因与pET32a载体连接构建表达载体。随后向导入pET32a/EoblPBP2表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中对其表达载体加入终浓度1 mmol·L~(-1)的IPTG进行蛋白的诱导表达,进一步利用镍NTA琼脂糖凝胶柱和含有咪唑的上清缓冲液分离目的蛋白,以PBS缓冲液作为透析液纯化得到高浓度重组蛋白。最后通过荧光竞争法,利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子以放大荧光信号,随后向重组蛋白与1-NPN混合体系中分别加入(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯以及10种测试气味后经过分子荧光光度计扫描得到相对荧光值,计算各配基的解离常数KD,研究重组蛋白与茶尺蠖性信息素和茶树挥发物的生理功能。【结果】EoblPBP2全长为492 bp,编码了163个氨基酸,蛋白相对分子质量为15.9kD,等电点为4.983,具有保守的6个半胱氨酸,根据分子进化树分析其应归属于昆虫PBPs家族。结合功能结果显示,10种测试气味均能将1-NPN与茶尺蠖EoblPBP2重组蛋白的混合体系于420 nm处的相对荧光值降至50%以下。其中β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5种茶树挥发物质与EoblPBP2重组蛋白的结合能力较强,解离常数KD分别为7.923、14.830、30.368、28.068和27.597μmol·L~(-1)。而性信息素成分之一的(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯与EoblPBP2的解离常数KD仅为172.591μmol·L~(-1),仅小于苯甲醇的解离常数KD 230.880μmol·L~(-1),而远远大于上述5种气味物质。表明EoblPBP2重组蛋白具有茶尺蠖性信息素成分((Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯)和植物挥发物质广谱结合能力,而其与性信息素的亲和力弱于大部分测试植物挥发物。【结论】EoblPBP2能与包括性信息素成分在内的多种植物挥发物结合,可能是一种具备特殊复合功能的信息素结合蛋白,可用之进一步研究茶尺蠖的性信息素识别和传递途径。     

异源表达irrE转基因烟草的耐盐耐旱性

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测IrrE编码蛋白;通过NaCl和甘露醇模拟盐处理和干旱处理分析纯和转基因株系的耐盐耐旱性,通过测定抗逆相关生理指标鉴定其对植物耐逆的贡献。【结果】按照植物密码子对irrE进行改造,共优化了241个密码子;构建了高效植物表达载体GBI-IE;利用除草剂草甘膦作为筛选剂获得转基因再生幼苗,并通过PCR验证共获得15个独立的转基因株系;通过q RT-PCR分析从中选取两个表达量最高的株系GO1和GO2进行后续的抗逆性分析;Western blot验证IrrE编码蛋白在GO1和GO2中能正确翻译。转基因烟草耐盐耐旱性分析:种子萌发试验表明,正常1/2 MS培养基上,转基因株系GO1和GO2发芽率和非转基因野生型对照之间没有明显的差异。然而250 mmol·L~(-1)NaCl培养基上GO1和GO2萌发率分别为78.8%和90.0%,野生型仅为10.3%,分别提高了68.5%和79.7%。类似地,300 mmol·L~(-1)甘露醇条件下,野生型的萌发率为39.7%,转基因株系GO1和GO2分别提高了42.9%和50.8%;正常萌发的种子移栽到250 mmol·L~(-1) NaCl和300 mmol·L~(-1)甘露醇条件12 d后,转基因株系根长、侧根数以及鲜重等生理指标显著高于野生型对照;温室中正常生长30 d的苗期烟草在250 mmol·L~(-1) NaCl处理下,转基因烟草SOD、CAT活性比野生型对照分别提高了48.80%和88.55%,而MDA含量比野生型对照降低了61.61%,胁迫响应基因Nt ABF2、Nt LEA5、Ntzfp、Nt CDPK2在GO1和GO2转基因株系中表达量均显著高于非转基因野生型。和盐处理结果类似,300 mmol·L~(-1)甘露醇的处理下,转基因烟草的耐旱生理生化指标均优于非转基因对照。【结论】烟草中异源表达耐辐射异常球菌irrE可以显著提高耐盐耐旱性;其多效性耐非生物胁迫能力的提高表明其可作为植物耐逆基因工程的优良基因源。     

棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

【目的】克隆获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律。【结果】获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L^-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L^-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μl^-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。HaPEBP在棉铃虫幼虫的1-6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g^-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g^-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低。     

朱砂叶螨TcGSTM7的体外表达及其功能

【目的】朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种重要的农业害螨,长期化学防治导致其对多种药剂产生了抗性,因此明确该螨对化学药剂的解毒代谢机制对开展有效的抗性治理具有重要意义。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是节肢动物主要的解毒代谢酶之一,笔者前期研究中筛选出了朱砂叶螨体内高表达的一条GST基因TcGSTM7,该基因的表达在药剂处理下具有明显的可诱导性。因此,本研究以TcGSTM7为研究对象,进一步利用异源表达技术分析TcGSTM7重组蛋白和甲氰菊酯、丁氟螨酯的互作效应,以及利用RNAi沉默该基因的表达后,检测朱砂叶螨对这两种药剂的敏感性变化,为明确TcGSTM7在药剂代谢中的功能打下基础。【方法】利用NCBI数据库对TcGSTM7编码蛋白的序列特征进行注释,并在SWISS MODEL构建的蛋白三维结构中对相关结构域、结合位点以及活性中心等进行展示。利用异源表达系统在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达TcGSTM7重组蛋白,对重组蛋白进行分离纯化后使用特异性底物检测其GST催化活性,并通过检测杀螨剂对该蛋白活性的抑制效果分析其与甲氰菊酯和丁氟螨酯的互作效应。在此基础上,为明确TcGSTM7基因表达水平对朱砂叶螨药剂敏感性的影响,参照该基因的序列设计并合成特异dsRNA,利用叶碟饲喂法将其导入朱砂叶螨体内,经qPCR检测TcGSTM7表达水平显著下调后,进行生物测定分析基因沉默后朱砂叶螨对不同剂量甲氰菊酯和丁氟螨酯药剂敏感性的变化。【结果】TcGSTM7的氨基酸序列分析结果表明,其N端具有一个Mu家族GST特有的"thioredoxin-like"结构域,以及一个GSH的结合位点(G-site),在C端则具有催化底物结合域(H-site)。该蛋白具有9个α螺旋和4个β折叠结构,呈经典的"βαβαββα"排列方式。在三维结构预测的基础上,通过原核表达技术获得了TcGSTM7重组蛋白,该重组蛋白分子量为26 kD,与预测结果一致,并且具有GST蛋白的催化活性。TcGSTM7重组蛋白酶活性为673.26nmol·min-1·mg~(-1),其动力学常数Km为0.71 mmol·L~(-1),Vmax为109.54 nmol·min-1·mg~(-1)。药剂抑制试验结果表明甲氰菊酯和丁氟螨酯均可抑制TcGSTM7重组蛋白的酶活性,IC_(50)分别为0.038和0.2 mmol·L~(-1)。进一步利用叶碟饲喂法让朱砂叶螨取食dsRNA,对TcGSTM7的表达进行了干扰,qPCR检测表明取食48 h后,dsRNA对TcGSTM7的干扰效率达到52.88%。药剂敏感性测定结果显示,沉默TcGSTM7的表达后,朱砂叶螨对LC_(30)和LC_(50)的甲氰菊酯敏感性分别上升了9.0%和12.3%,对LC_(30)和LC_(50)的丁氟螨酯敏感性分别上升了12.9%和11.0%,且均达到显著水平(P0.05)。【结论】TcGSTM7的表达可以影响朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯的敏感性,且其重组蛋白和这两种药剂存在互作效应,表明TcGSTM7可能在朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯的代谢过程中具有重要作用。     

家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L~(-1)。在10℃处理2 h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2 h后,其活性完全丧失。Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L~(-1)。在20 mmol·L~(-1)浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L~(-1)时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L~(-1)时,Cu2+则抑制了BmALP活性。【结论】克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础。     

肌注氟苯尼考在鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药动学特征

【目的】研究并比较肌注氟苯尼考在2周龄健康和鸭疫里氏杆菌感染鸭体内的药代动力学特征。【方法】240只鸭随机分为2组,各120只鸭,其中一组用鸭疫里氏杆菌腿部感染,分别以30 mg·kg~(-1)体重单剂量肌内注射氟苯尼考,采血点为给药前和给药后5、10、15、20、30、45 min和1、1.5、2、4、8、10、14 h。采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆氟苯尼考的浓度,采用紫外检测器检测,检测波长为223 nm,流动相为乙腈和水,其体积比为26和74,流速为1 m L·min-1,色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×150 mm,5μm),进样量为20μL。药动学分析软件Win Nonlin 5.2.1以非房室模型拟合处理血药浓度-时间数据,计算相关的药动学参数,并用统计学软件SPSS17.0对药动学参数进行t检验统计学分析。【结果】氟苯尼考在健康鸭体内的峰浓度(Cmax)为(22.88±3.11)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.39±0.81)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.64±0.11)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.57±0.51)h和药时曲线下面积(AUC)为(47.28±7.87)μg·m L-1·h;氟苯尼考在感染鸭体内的峰浓度(Cmax)为(19.77±1.82)μg·m L-1,表观分布容积(Vd/F)为(2.44±0.46)L·kg~(-1),体清除率(ClB/F)为(0.63±0.08)L·h-1·kg~(-1),消除半衰期(t1/2β)为(2.74±0.54)h和药时曲线下面积(AUC)为(48.11±6.62)μg·m L-1·h。统计分析氟苯尼考在健康鸭和感染鸭的药动学参数,结果表明,除了Cmax差异显著(P0.05),其他参数差异均不显著(P0.05)。【结论】两者的主要药动学参数相比较,感染鸭体内的Cmax显著低于(P0.05)健康鸭体内的C_(max),其他参数无显著性差异。氟苯尼考以30 mg·kg~(-1)体重肌内注射在健康和感染鸭体内具有吸收迅速,峰浓度高,体内分布广泛,消除较快的特点。     

基于1H NMR技术的奶牛I型和II型酮病血浆代谢谱分析

【目的】运用代谢组学中¹H NMR技术方法筛选出Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组之间血浆差异性代谢物。【方法】选取产后7—28 d,平均胎次为2—3胎的实验奶牛50头。根据血糖（Glc）、β-羟丁酸（BHBA）和游离脂肪酸（NEFA）的含量与临床发病特点分为Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组,其中Ⅰ型酮病20头,Ⅱ型酮病为20头,健康对照组为10头。当患病牛血中BHBA＞1.20 mmol·L^-1,Glc＜2.50 mmol·L^-1,NEFA＞0.50 mmol·L^-1时,被认为患I型酮病;当患病牛血浆中BHBA＞1.20 mmol·L^-1,Glc＞2.80 mmol·L^-1, NEFA＞0.50 mmol·L^-1时,被认为患II型酮病;当奶牛血中BHBA＜1.00 mmol·L^-1,Glc＞3.75 mmol·L^-1,NEFA＜0.40 mmol·L^-1时,被认为健康对照组。运用代谢组学中¹H NMR技术对实验奶牛的血浆代谢物分析,获得相应的代谢图谱,并结合多元统计分析中的主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）的模式判别,从而寻找潜在的生物标记物。【结果】通过¹H NMR分析,Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照的代谢图谱差异明显,3组代谢产物各自聚集,分散区域显著。Ⅱ型酮病与健康对照比较,获得7种血浆差异代谢物,主要为丙氨酸、赖氨酸、β-羟丁酸、丙酮、乳酸等,其中血浆中β-羟丁酸、丙酮、乳酸浓度升高;丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、肌酸浓度呈现下降。Ⅰ型酮病与健康对照组比较,获得19种血浆差异代谢物,主要为酪氨酸、苯丙氨酸、肌酸、β-羟丁酸、丙酮等,其中β-羟丁酸、丙酮浓度升高;酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、丙氨酸、肌酸、肌醇、β-葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、柠檬酸、α-葡萄糖、甲酸、甘氨酸、O-乙酰葡萄糖胺、磷酸胆碱浓度呈现下降。Ⅰ型酮病与Ⅱ型酮病比较,获得24种血浆差异代谢物,主要为柠檬酸、组氨酸、β-葡萄糖、异亮氨酸、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白等,其中β-羟丁酸、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白、异亮氨酸、缬氨酸、丙酮、亮氨酸、乙酸浓度升高;柠檬酸、酪氨酸、组氨酸、肌醇、谷氨酰胺、β-葡萄糖、苯丙氨酸、谷氨酸、α-葡萄糖、赖氨酸、甲酸、甘氨酸、磷酸胆碱、丙氨酸、O-乙酰葡萄糖胺浓度呈现下降。【结论】¹H NMR技术与多元统计分析的有效结合能够有效的筛选出Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组之间血浆差异性代谢物,为进一步探究奶牛Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病的发病机理和诊断与防治提供了新的方向。