基于SNP标记的桃矮化基因精细定位

【目的】矮化型桃树体矮小、节间短,是盆栽观赏和砧木育种的重要遗传资源。明确矮化性状形成的遗传机制并对桃矮化基因进行精细定位,是建立目标性状分子辅助选种体系和遗传改良的前提,可为有目标的选育矮化观赏桃和砧木品种奠定基础。【方法】以‘05-2-144’(‘97矮’ב鸳鸯垂枝’桃)套袋自交获得的395个后代单株构建的分离群体为材料。参考桃基因组信息并基于Sanger技术开发的SNP标记对亲本和后代单株进行分析,在扩大群体单株中进行连锁关系分析,确定连锁的SNP标记,初步定位目标基因。在定位区域内基于二代测序技术开发更多的基因型和表型一致的SNP标记,对后代单株进行基因分型,完成目标性状的精细定位。然后在精细定位区域内开发SNP标记,即杂交群体双亲均为Aa杂合基因型,对‘10-7’ב96-5-1’杂交后代89个单株进行分子鉴定,以验证基因定位结果的准确性。【结果】通过对桃单株‘05-2-144’自交后代实生苗表型鉴定表明,普通型和矮化型单株数分别为300株和95株,性状分离比例接近3﹕1(P值为0.67;χ2为0.19),符合孟德尔遗传规律,桃矮化性状受隐性单基因控制。用于分子鉴定的单株来源于‘10-7’(普通型)ב96-5-1’(普通型)杂交组合,共获得89个后代单株,其中普通型66株;矮化型23株(P值为0.854;χ2为0.034)。基于Sanger测序技术开发了SNP标记,在桃基因组数据库Pp06上25 230 425 bp和27 191 090 bp处获得了连锁的SNP标记,且目标基因位于这两个标记的右侧,初步获得了连锁的SNP分子标记。在此基础上,对亲本进行66.89X深度测序,继续开发符合Aa杂合基因型的SNP标记位点。根据参考基因组和物理距离区间共设计了15对SNP引物,其中12对引物与重测序结果中SNP的类型一致,3对引物与重测序结果中SNP的类型不一致,连锁标记的基因分型成功率为80.0%。通过基于SNP基因分型分析,最终完成了目标性状的精细定位,位点位于Pp06的28 712165 bp(引物为JXSNP-5)和28 899 661 bp(引物为JXHRM-SNP-3)之间,遗传距离分别为0.38 c M和0.13 c M,物理距离约为277 kb,精细定位区域内有54个已知转录本。在定位区域内桃基因组Pp06的28 108 436 bp处和29 247 763 bp处开发SNP标记用于杂交后代表型的鉴定,结果表明所有后代单株基因型和表型鉴定结果完全一致,鉴定准确率为100%。【结论】本研究精细定位了桃矮化基因,物理距离约为277 kb,为基因克隆、亲本早期筛选以选育矮化观赏桃和砧木品种等奠定了基础。     

利用基于HRM的功能标记分析水稻Wx和fgr的基因型

Wx和fgr基因分别调控水稻直链淀粉含量和香气形成。在基于凝胶电泳功能标记的基础上，发展基于高分辨率熔解曲线(HRM)的功能标记Wx–a/b和BAD2–E7, 分别用于鉴定88份水稻种质Wx和fgr的基因型。利用LightScanner 96平台进行HRM检测，单次检测在10 min内即可完成最多96个样品的基因型分析。结果表明，88份水稻种质中，25份含纯合Wxa基因型的种质，直链淀粉含量为25.08%；59个含纯合Wxb基因型的种质，直链淀粉含量为15.00%，其余4个杂合型(Wxa/Wxb)的直链淀粉含量为18.13%。携带纯合fgr基因的3份种质(巴太香占、象牙香占和Basmati 370)，其全部米粒均带有香气，而携带杂合fgr的2份种质，只有部分米粒带有香气。     

利用HRM功能标记检测黑龙江省水稻种质资源Wx和fgr的基因型分布

水稻直链淀粉含量与香味作为水稻重要的品质性状,一直是水稻研究热点。HRM（高分辨率熔解曲线）技术作为近年来新兴的PCR分析技术,拥有简便、快速及分辨率高等特点,备受关注。为明确黑龙江省种质资源中Wx及fgr基因的分布情况,利用HRM功能标记Wx-a/b和fgr-E7FNP,在67份部分黑龙江省主栽品种及优异种质资源中进行基因分型,结果表明,67份种质均含有纯合Wx^b基因;4份种质含有纯合的fgr基因,分别为哈99352、龙粳香1号、中龙香粳1号及龙交103970,其余63份种质含纯合野生型BAD2基因。     

利用HRM功能标记检测黑龙江省水稻抗稻瘟病基因Pita和pik的基因型分布

为明确Pita及pik基因在黑龙江省水稻种质资源中的分布情况,本研究以67份黑龙江省主栽品种及优异种质资源作为试验材料,通过HRM技术,利用Pita及pik的HRM功能型分子标记Pita-G/T、Pik2-C/T,对67份材料进行基因分型。结果表明,67份种质中,含纯合Pita有27份,占参试种质的40.3%;纯合pik有22份,占参试种质的32.9%,同时含有两基因的为12份,比例为17.9%。综上,Pita-G/T及Pik2-C/T 标记可以高效准确地对黑龙江水稻资源进行基因分型,同时,通过基因分型,明确了Pita及pik在黑龙江省的分布情况,为抗稻瘟病育种提供了理论基础。     

桃SRAP-PCR反应体系建立及与半矮生型相关标记的研究

试验采用常规CTAB法提取了桃叶片基因组DNA,并以半矮生型桃基因组DNA为模板,通过对影响扩增结果的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度及引物浓度的梯度试验,对桃SRAP-PCR反应体系进行了优化.结果表明:桃SRAP-PCR的最佳反应体系为DNA模板25～30ng,10×Buffer2μL,Mg2+浓度2.5mmol·L-1,dNTP浓度0.25mmol·L-1,Taq酶1.1U,引物浓度0.3μmol·L-1.通过BSA法建立半矮生型和普通型基因池,从266对SRAP引物中筛选出21对与桃半矮生性状相关的SRAP标记,并通过对18个个体的扩增检测,发现了1个与半矮生性状相关的标记.     

虾夷马粪海胆溶菌酶基因SNP标记的开发及多态性分析

采用高分辨率熔解曲线分析技术（HRM）对虾夷马粪海胆溶菌酶基因进行突变扫描,筛选出26个SNP候选位点。其中,碱基置换类型位点16个,占位点总数的61.54%;碱基插入或缺失的位点6个,缺失的碱基数为1~4个不等,占位点总数的23.08%;碱基置换类型模糊以及三态位点4个,占位点总数的1538%。SNP在虾夷马粪海胆溶菌酶基因的cDNA中的分布频率约为2.85%,位于编码区的位点有18个,其中2个为错义突变。应用小扩增子基因分型法对5个SNP位点在2个不同地域群体的60个样本中进行分型分析,结果显示：5个SNP位点均含有2个等位基因,次等位基因频率分布范围为0.150 0~0.500 0,位点SILyz-7、SILyz-15和SILyz-20在两个群体间的次等位基因频率相差较大。研究结果表明,HRM是一种高效便捷的SNP分析方法,所筛选出的SNP标记可用于虾夷马粪海胆遗传育种的研究。     

利用HRM标记检测山东省稻瘟病菌群体的交配型分布

为明确山东省不同年份不同地区稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)群体的交配型分布,本研究以标准菌株S1528(MAT1-1)和P131(MAT1-2)做对照,利用高分辨率熔解曲线法对2016—2020年从山东省分离到的415株稻瘟病菌进行交配型测定。结果表明,山东省稻瘟病菌群体中同时存在MAT1-1和MAT1-2两种交配型,主要以交配型MAT1-2为主,出现频率为79.28%,交配型MAT1-1出现频率为2.89%。不同年份间稻瘟病菌群体交配型的出现频率存在差异,交配型MAT1-2在2016、2017、2018、2019、2020年的出现频率分别为73.33%、82.54%、65.74%、72.53%、99.07%。不同地区稻瘟病菌交配型存在差异,交配型为MAT1-2的菌株在鲁北地区出现频率最高,为87.40%,在鲁中和鲁南出现频率分别为79.67%和72.73%。表明山东省水稻稻瘟病菌株群体交配型存在多样性。     

基于HRM技术的草鱼抗小瓜虫nlrc3基因SNP标记开发及关联分析

为探究草鱼nlrc3基因的多态性和抗多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）病之间的关联性,通过多子小瓜虫感染草鱼（Ctenopharyngodon idella）筛选出易感群体和抗病群体,并分析比较两个群体nlrc3基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）位点,使用高分辨率熔解（High resolution melt, HRM）和Sanger测序技术验证SNP位点基因型,并将获得的SNP位点与草鱼抗病性状进行关联性分析。结果显示,从草鱼nlrc3基因中筛选得到了4个SNPs位点,有3个SNPs位点（SNP1、SNP3和SNP4）成功分型,其中SNP1和SNP3中分别含有AA、AG和AA、GG两种基因型,且与抗多子小瓜虫性状显著相关;倍型组合及其与抗病能力相关性分析显示,与其他二倍型相比,由SNP1的AG和SNP3的AA基因型组成的二倍型（D1）中100%为抗病个体,由SNP1的AG与SNP3的GG基因型组成的二倍型（D2）中95%为抗病个体,均为抗病优势基因型。研究表明,抗小瓜虫的草鱼全体中存在nl...     

利用CottonSNP63K芯片构建棉花品种的指纹图谱

【目的】利用SNP位点的单拷贝特性,结合陆地棉TM-1参考基因组序列信息,筛选基因组特异的SNP。【方法】以719份遗传背景来源广泛的陆地棉种质资源为材料,采用Illumina公司开发的Cotton SNP63K芯片,利用Genome Studio软件对芯片扫描所获得原始数据进行基因型数据质量控制,获得待测样品SNP位点的基因型数据。根据已公布的陆地棉TM-1基因组的两个版本——中国农业科学院棉花研究所版本Gossypium hirsutum(AD1)genome BGI v1.0与南京农业大学版本G.hirsutum(AD1)genome NBI v1.1为参考序列,对Cotton SNP63K芯片(63 058个SNP)各位点的侧翼序列分别进行全基因组Blast比对分析,以筛选具有单拷贝特性的特异SNP位点并用于样品指纹图谱的构建。【结果】利用Cotton SNP63K芯片对719份材料进行SNP位点基因分型,主要表现为无检出信号的SNP位点、无多态性的SNP位点、具有多态性的SNP位点,而具有多态性的SNP位点的分型结果又可分为单位点SNP(基因组特异SNP)、双位点SNP和多位点SNP。通过对两个已公布的陆地棉TM-1参考基因组序列Blast比对结果表明,中国农业科学院棉花研究所TM-1基因组版本比对获得基因组特异SNP标记为5 474个,而南京农业大学TM-1基因组版本比对获得基因组特异SNP标记仅为1 850个,两者共有的特异SNP为1 594个,进一步通过分型效果、检出率及多态性3个评价指标,筛选score值≥0.7,call frequency值≥0.95,且MAF值≥0.2的SNP位点,获得471个分型效果理想,检出率高且多态性较高的特异SNP位点。在471个SNP位点中,430个位于染色体上,41个位于scaffold片段上。考虑到标记间的连锁程度,剔除连锁标记37个,最终获得393个核心SNP位点。利用393个核心SNP构建了719份品种资源的特征DNA指纹图谱,除个别材料之间遗传背景高度相似、基因型完全一致外,97%的材料均能实现准确有效的鉴别。【结论】筛选出393个基因组特异的SNP,并利用这些核心SNP构建了719份资源材料的特征DNA指纹图谱,为SNP分子标记应用于棉花重要性状遗传改良提供了参考。     

利用2b-RAD测序结合HRM分析技术开发与梨矮生性状相关的DNA分子标记

【目的】果树的矮生性状是一种重要的农艺性状,对果树的集约化栽培具有重要意义。来自西洋梨实生变异品种‘Le Nain Vert’的矮生性状受控于一个单显性基因Pc Dw,目前关于该基因的序列信息等还不清楚。本研究的目的是开发与其紧密连锁的DNA分子标记,为鉴定该基因提供依据。【方法】根据分离群体分组分析的原理,以‘矮生梨’ב茌梨’和‘2-3’ב绿宝石’2个F1杂交分离群体为试材,应用IIB型限制性内切酶的RAD技术(Restriction association site DNA,2b-RAD)对2对矮生型/普通型对比基因池进行基因组测序分析,在对比基因池间筛选出单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,从中筛查出位于Pc Dw定位染色体上的SNPs,用高分辨率熔解曲线分析技术(High-resolution melting analysis,HRM)在群体上进一步检测验证,以确定其与Pc Dw位点的连锁关系。【结果】对4个样本(即4个对比基因池)的2b-RAD标签测序文库的测序结果共产生67 186 260条reads,平均每个样本测序reads数为16 796 565。将原始reads进行质量过滤后的统计结果表明,每个样本获得平均unique标签数目为86 810,平均测序深度为77×,该测序深度能够达到准确分型的标准。SOAP软件定位结果表明,4个测序文库中含有酶切位点的高质量reads占测序原始reads的70%以上,表明测序质量较好。在来自2个不同群体的矮生型基因池与普通型基因池间进行对比分析,初步筛选出SNP位点1 317个,其中有8个位于PcDw的定位染色体scaffold00074上。用HRM技术对这8个SNP标记在群体上的进一步检测结果表明,在‘矮生梨’ב茌梨’群体上有2个SNP标记、在‘2-3’ב绿宝石’群体上有4个SNP标记表现出与Pc Dw位点共分离的特性,根据其扩增子的熔解曲线形状差异,可有效区分矮生型和普通型表型。在来自‘矮生梨’ב茌梨’群体的215个杂种后代和来自‘2-3’ב绿宝石’群体的168个杂种后代中,未发现有标记与性状的重组类型。【结论】2b-RAD测序技术与HRM分析技术相结合,进行果树重要农艺性状分子标记的开发,是一种行之有效的方法。基于这一策略,本研究鉴定获得了4个与西洋梨矮生性状单显性基因Pc Dw连锁的SNP标记。     

基于高分辨质谱和代谢组学技术评估和优化蜂王浆代谢物提取方法

【目的】蜂王浆是具有医疗保健功效的天然产品,含有丰富的小分子活性成分,目前蜂王浆代谢物的提取尚缺乏系统研究。通过蜂王浆代谢轮廓分析,比较不同溶剂对蜂王浆小分子化合物的提取效果,优化蜂王浆代谢物提取方法,鉴定蜂王浆中的代谢物。【方法】分别使用6种溶剂（50%和80%的甲醇、乙醇和乙腈）提取蜂王浆代谢物,运用反相液相色谱（reverse phase liquid chromatography,RPLC）和亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC）分别联合四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术（Q-exactive orbitrap HRMS）进行检测。比较不同溶剂组的代谢特征离子数量和相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）,并进行主成分分析（principal component analysis,PCA）。利用质谱数据库定性代谢物,并经标准品验证,比较其RSD差异,进行聚类热图（clustering heatmap）分析。通过正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA）、单变量统计分析（student’s t-test）和倍数变化（fold change,FC）筛选溶剂组间具有显著差异的代谢物。【结果】强极性化合物,包括葡萄糖与果糖等同分异构体,在HILIC条件下分离良好,而脂类等中低极性化合物在RPLC条件下得到较好的分离。两种色谱分离方法的应用实现了对不同极性代谢物的检测,在蜂王浆中共鉴定到70种高丰度化合物,涵盖了糖、氨基酸、脂类、维生素等,其丰度差异高达8 340倍,其中有17种化合物为本研究首次报道。乙腈溶剂得到的代谢特征离子数量最少,80%乙腈比50%乙腈的提取效果更差;对甲醇和乙醇而言,高浓度时的代谢特征离子数量更多。所有溶剂组得到的RSD值集中分布在20%范围内,但80%乙腈组在10%内的占比最低,已鉴定的70种代谢物的RSD值进一步证明80%乙腈的重复性较差。PCA结果表明,来自同一提取溶剂的蜂王浆代谢谱高度相似,不同溶剂提取的样品间存在差异,其中,80%乙腈组与其他5组差异最大。聚类热图等分析结果表明,中低极性物质在50%溶剂组丰度较低,强极性物质特别是果糖、葡萄糖、蔗糖、赖氨酸、腺苷、胆碱、磷酸胆碱和葡萄糖酸在80%乙腈组丰度最低。【结论】RPLC和HILIC分别联合高分辨质谱技术能够较全面准确地检测蜂王浆中的小分子化合物,80%甲醇或80%乙醇是提取蜂王浆代谢物的最佳溶剂。