苹果绵肉与脆肉株系果实质地差异的分子机理

【目的】研究新疆红肉苹果（Malus sieversii脆2号’ f. neidzwetzkyana）与‘富士’苹果品种（M. domestica cv. Fuji）杂交后代绵/脆肉株系果实质地差异的分子机理,旨在为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供科学依据。【方法】以新疆红肉苹果杂交后代‘红绵2号’和‘红脆2号’不同发育时期的果实为试材,检测乙烯释放量、果实硬度与脆度以及ACS1等4个乙烯生物合成基因和PG等30个果实软化相关基因的相对表达量,观察其变化。【结果】‘红绵2号’和‘红脆2号’苹果果实发育期间的硬度和脆度均呈下降趋势,但‘红脆2号’各时期果实硬度和脆度均明显高于‘红绵2号’。‘红绵2号’花后120 d乙烯释放速率明显上升,并出现明显的乙烯释放峰;而‘红脆2号’花后120 d乙烯释放速率上升不明显,且无明显的乙烯释放峰。‘红苹果果实各时期的ACS1、ACS3、ACO1和ACO2 4个乙烯生物合成相关基因表达量均明显低于‘红绵2号’;4个乙烯生物合成相关基因的表达模式存在明显差异,其中‘红绵2号’ACS1、ACO1和ACO2三个基因在果实发育后期的表达量均在94%以上,而ACS3a在果实发育前、后期表达量分别占50%,表现为组成型表达。所检测的与果实软化相关的30个基因表达的时间顺序存在明显差异,其中PL、AF1、EG2及XET1等15个基因主要在果实发育前期表达,PG、AF3、XET2、XET10和XET11 5个基因主要在果实发育后期表达,基因表达量均占总表达量的70%以上;除PL和AF1等6个基因外,‘红脆2号’PG等24个基因的总表达量均极显著低于‘红绵2号’。【结论】果实发育后期乙烯释放高峰的到来以及果实发育前、后期不同乙烯生物合成与果实软化相关基因的上调表达,是导致‘红绵2号’果实在采收前就已软化变绵及其与‘红脆2号’质地差异的主要原因。     

‘幸香’草莓白肉突变体与野生型的生物学特性和品质比较

【目的】比较‘幸香’草莓白肉突变体与野生型在生物学特性及果实品质上的差别,为探讨草莓白肉果实形成原因,以及进一步揭示草莓果实品质形成机理奠定基础。【方法】以‘幸香’草莓白肉突变体及野生型植株为试材,记录物候期,调查植株形态指标,测定光合特性,统计产量,测定糖含量、花色素苷含量、香气等果实品质相关指标,分析白肉突变体与野生型在各项指标上的差异。【结果】白肉突变体与野生型在物候期上相近;白肉突变体的叶片数显著低于野生型,而中间小叶的叶面积大于野生型,二者的单株总叶面积和光合特性相关指标差异不显著;在红熟期,白肉突变体果肉中花色素苷含量仅是野生型中的13.7%,而白肉突变体可溶性总糖含量显著高于野生型;白肉突变体果实中酯类物质含量高于野生型,在粉熟期,突变体果实中橙花叔醇和沉香醇的含量分别是野生型的40.8倍和3.1倍。【结论】‘幸香’草莓白肉突变体果实中花色素苷含量比野生型大幅度减少,同时糖含量和香气物质含量增加,但是,突变体与野生型的单株总叶面积和光合特性没有明显差异。     

苹果MdcyMDH过量表达对光合、激素和生长的影响

【目的】获得过量表达苹果细胞质苹果酸脱氢酶基因（MdcyMDH）的苹果植株,评价其过量表达对转基因株系生长的影响,并通过光合特性和和激素水平来探讨其调控生长的机理,为进一步揭示该基因调控生长发育的机制奠定基础。【方法】从苹果叶片中克隆MdcyMDH编码区,连接植物表达载体pBI121,转化农杆菌LBA4404;利用农杆菌侵染‘嘎啦’苹果叶片,通过叶片再生的方法获得MdcyMDH过表达的转基因苹果株系。以分化的苹果组培苗叶片为材料,提取基因组DNA,利用来自35S启动子和转化基因序列的引物,通过PCR初步筛选转基因株系;然后,提取初筛的转基因苹果组培苗叶片RNA,分别采用半定量和荧光定量PCR的方法检测MdcyMDH表达量,来确定MdcyMDH过表达株系。以继代培养40和60 d的野生型和转基因苹果组培苗为材料,进行生根处理,30 d后测定MdcyMDH过表达对组培苗表型以及株高、叶片数量、根重等生长参数的影响。以驯化的、在大田生长一年的野生型和转基因苹果苗为材料,测定叶片光合参数和叶绿素含量的变化;以组培苗为材料,利用液质联用仪测定叶片内源激素含量的变化。【结果】以苹果叶片基因组DNA为材料,PCR初步筛选获得了3个转基因株系,即Line 2、Line 3和Line 4;半定量和荧光定量PCR检测发现Line 2和Line 4中MdcyMDH表达量分别比野生型提高了12倍和5倍,因此确定以上两个株系为MdcyMDH过表达株系。此外,MdcyMDH过量表达也提高了叶绿体苹果酸脱氢酶基因（MdchMDH）表达量。组培苗生根培养30 d后,MdcyMDH过表达对转基因株系的株高、叶数目、茎粗度、地上部重量未造成显著性影响,但小幅提高了转基因株系的株高和地上部总重量;与野生型相比,MdcyMDH过量表达显著提高了根系的重量和总鲜重。MdcyMDH过表达显著提高了转基因株系的光合速率,Line 2和4光合速率分别提高了13.2%和15.1%;转基因株系的蒸腾速率和气孔导度总体上都有显著性提高,但其胞间CO₂浓度显著降低;MdcyMDH过量表达显著提高了叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总含量,与对照相比,Line 2和4株系叶绿素总含量分别提高了20.4%和15.9%。叶片激素含量测定表明,MdcyMDH过量表达显著抑制了ABA水平,其含量约为对照的1/2。【结论】MdcyMDH过量表达通过提高光合能力和降低ABA水平促进了转基因苹果组培苗的生长,尤其是促进了生根。     

华东葡萄抗白粉病VpMYBR1基因表达与功能分析

【目的】从华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’中克隆VpMYBR1基因,并进行基因表达与功能分析,为揭示抗白粉病机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE技术克隆VpMYBR1 基因cDNA全长序列,并利用半定量和定量RT-PCR技术进行不同器官和不同处理后的表达分析;通过花序浸染法转化拟南芥,对转基因及未转化对照植株抗白粉病鉴定、台盼蓝染色和抗病标记基因表达分析研究基因功能。【结果】VpMYBR1基因cDNA序列全长539 bp,有228 bp的完整开放阅读框,编码75个氨基酸,包含1个Sant/myb结构域,GenBank 登录号为HQ284197;VpMYBR1基因在‘白河-35-1’不同器官中均有表达,且叶中的表达量最强,花序和果实中表达量最弱;VpMYBR1基因的表达在抗白粉病的华东葡萄‘白河-35-1’与感病的‘湖南-1’、抗病的毛葡萄‘商-24’叶片接种白粉菌6 h后达到最大值,而且在‘白河-35-1’中最高,达接种前的28倍。同样,VpMYBR1基因在SA、MeJA处理后的‘白河-35-1’中的表达量明显高于‘商-24’和‘湖南-1’;将VpMYBR1基因导入野生型拟南芥,提高了转基因株系的抗病性;台盼蓝染色和抗病标记基因表达分析表明,该基因可能通过过敏反应（hypersensitive reaction, HR)提高了转基因株系的抗病性。【结论】从华东葡萄克隆了VpMYBR1基因,基因表达及功能分析表明,该基因具有提高转基因植株白粉病抗性的功能。     

干涉丹参SmORA1对植物抗病和丹参酮类次生代谢的影响

【目的】乙烯响应因子（ethylene response factor,ERF）是植物特有的一类转录因子,普遍参与植物各类胁迫反应。前期从药用植物丹参（Salvia ）中筛选得到了一条与长春花（Catharanthus roseus）中CrORCA3高度同源的ERF转录因子编码基因（命名为SmORA1）。论文旨在通过干涉丹参SmORA1的表达,进一步明确SmORA1在植物抗病反应与丹参酮合成代谢调控中的作用miltiorrhiza侵染后转基因株系中丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase,PAL）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase,SOD）等抗性相关酶活性和还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）、脯氨酸（proline,Pro）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量等抗性相关生理指标的变化;采用HPLC法考察干涉SmORA1表达对二氢丹参酮、隐丹参酮和丹参酮ⅡA等丹参酮类次生代谢物含量的影响;采用实时定量PCR考察干涉SmORA1对丹参株系抗性基因和丹参酮合成相关关键酶基因表达的影响。【方法】扩增SmORA1基因片段,构建SmORA1基因干涉载体pk-ORAi并采用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参,经抗生素抗性筛选和PCR鉴定获得阳性转基因丹参植株;采用分光光度法或酶联免疫方法检测立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。【结果】经抗生素和PCR筛选获得了11个阳性株系,进一步采用实时定量PCR分析得到3个SmORA1表达显著下调的转基因株系（RNAi-11、RNAi-18、RNAi-22）,干涉效率达到80%以上。立枯丝核菌对丹参植株有明显的致病力,可以有效诱导丹参发病;其侵染后,SmORA1-RNAi转基因株系病情指数显著高于野生型（WT）和空载（VK）对照株系,病情更严重;SmORA1-RNAi转基因株系中的MDA含量显著高于WT和VK对照株系,说明干涉SmORA1的丹参株系抗衰老能力显著下降;植物抗性相关的PAL、CAT和SOD等酶活性以及GSH和Pro等物质含量显著低于对照株系,说明干涉SmORA1的丹参株系抗病性也呈现明显减弱;进一步研究发现SmORA1-RNAi转基因株系中抗病性相关蛋白编码基因SmPDF1.2、SmSTH-2和SmPR-10的表达量明显低于对照株系。采用HPLC方法分析发现,丹参SmORA1干涉株系中丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量显著下降;同时采用实时定量PCR检测分析,发现丹参SmORA1干涉株系中丹参酮合成途径关键酶基因SmHMGR1、SmHMGR2、SmGPPS、SmGGPPS1和SmGGPPS3等表达显著下调,说明SmORA1可能通过调节SmHMGR1、SmHMGR2、SmGPPS、SmGGPPS1和SmGGPPS3等丹参酮合成途径关键酶基因的表达参与丹参酮类化合物的合成调控。【结论】丹参SmORA1参与了丹参抗病反应,而且与丹参酮类次生代谢物质的合成密切相关。     

16个苹果品种非浓缩还原汁的理化特征分析

【目的】通过研究16种苹果非浓缩还原汁（not from concentrate,NFC）果汁的8项理化指标,利用相关性分析明确指标间的关系,以简化NFC果汁品质的评价指标。此外,利用多元数据处理对不同品种苹果NFC果汁进行归类,以找到NFC果汁生产中制汁和智能复配的替代品种,为NFC果汁产业发展提供理论参考。【方法】以16个苹果品种为试材,经榨汁、灭酶、巴杀、热灌装等单元操作制备NFC果汁。通过测定16种果汁的可溶性固形物含量、pH、可滴定酸含量、固酸比、表观黏度、浊度、总酚含量及色泽品质（L^*、a^*、b^*、C^*、h°）指标,采用单因素方差分析与相关性分析对测定结果进行显著性和相关性分析。此外,利用主成分分析（PCA）、线性判别分析（LDA）、聚类分析（CA）多元数据处理方法,对16种果汁的理化指标数据矩阵进行分析,获得16个苹果品种的综合品质分类。【结果】16种苹果汁的各项理化指标均存在显著差异,其中,‘新世界’的可溶性固形物含量和浊度最高,分别为15.7 °Brix和3 720 NTU;‘澳洲青苹’的pH最低,为2.74;‘红玉’的可滴定酸含量最高,为9.6 g·L^-1（苹果酸当量）;‘秦艳’的固酸比最高,为39.24;‘元帅’‘恩派’‘桔苹’都表现出最高的表观黏度,均为3.75 mPa·s;‘富士’的总酚含量最高,为775.94 mg·L^-1（没食子酸当量）。果汁pH与固酸比（R²=0.844）、浊度与L^*值（R²=0.967）均呈极显著正相关关系（P<0.01）,pH与可滴定酸含量（R²=-0.896）、固酸比与可滴定酸含量（R²=-0.918）均呈极显著负相关关系（P<0.01）。PCA、LDA和CA的分类结果完全一致,16个品种的NFC苹果汁可分为3大类,同一大类中各品种之间不同理化指标差异较小,品质、色泽十分接近,可作为NFC果汁生产和智能复配的可替代品种。【结论】可溶性固形物含量、可滴定酸含量、色值、表观黏度、总酚含量5项理化指标,可全面反映NFC果汁的品质。在果汁品质分类中,‘玉华早富’和‘乔纳金’归为一类,‘新世界’和‘秦冠’归为一类,‘新红星’‘富士’‘桔苹’‘自由’‘秦艳’‘澳洲青苹’、‘秋香’‘粉红女士’‘元帅’‘恩派’‘凉香’‘红玉’归为一类,同一类别中NFC果汁品质接近,可作为制汁和智能复配的替代品种。     

猕猴桃果实发育过程中淀粉积累差异及其糖代谢特性

【目的】探讨高、低淀粉积累型猕猴桃果实发育过程中淀粉积累差异、糖代谢特性及与相关酶活性的关系,为提高猕猴桃果实糖含量和风味等关键品质提供理论依据。【方法】以高淀粉积累型品种‘红阳’和低淀粉积累型品种‘华特’为试材,测定果实发育过程中的相对生长速率、碳水化合物（淀粉、葡萄糖、果糖和蔗糖）含量、干物质含量以及碳水化合物代谢相关酶活性的变化。【结果】果实碳水化合物含量与果实生长速率呈负相关,其含量随淀粉积累而不断增加;淀粉含量与果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖含量及干物质含量均呈正相关,当达峰值时,其在‘华特’和‘红阳’果实碳水化合物含量中所占比例分别为87.1%和84.1%。‘红阳’果实淀粉积累增速快、峰值高、时间长,其淀粉积累平均速率为0.685 mg•g-1FW•d-1,淀粉积累峰值为70.78 mg•g-1FW,分别是‘华特’的1.34倍和1.69倍,且其淀粉积累时间比‘华特’长21 d。‘华特’果实淀粉在采前已急剧下降,至采收时几乎都转化为可溶性糖;而‘红阳’果实淀粉含量仍直线增长,并在采前维持在一个较高水平。‘华特’果实的中性转化酶（NI）和酸性转化酶（AI）活性始终显著高于‘红阳’,而后者的蔗糖磷酸合成酶（SPS）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）活性一直明显强于前者。‘红阳’和‘华特’的果实淀粉含量与AGPase和SPS活性的相关性最强,而与NI和AI活性呈较强负相关。NI活性与AI活性呈显著正相关,而与AGPase、SPS、蔗糖合成酶（SS）、果糖激酶（FK）、葡萄糖激酶（GK）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）等酶活性均呈负相关;‘红阳’果实中的AGPase活性与SPS、SS、FK、GK、UGPase等酶活性均呈显著正相关。【结论】猕猴桃果实碳水化合物积累以淀粉为主,AGPase是影响淀粉积累的关键酶,NI、AI和SPS活性的差异可能是造成果实淀粉积累高低、干物质多少、可溶性糖组分及含量不同的重要原因。     

中国主栽葡萄柚果肉酚类物质组成及其抗氧化活性

【目的】对不同品种葡萄柚（Citrus paradis Macfad.）的酚类物质组成及其抗氧化能力进行比较研究,为柑橘育种及葡萄柚资源的利用提供科学依据。【方法】以中国主栽的9个葡萄柚品种为材料,使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）法检测分析各品种果肉酚类物质的组成、含量与分布情况,用自由基清除（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals, DPPH）、铁离子还原（ferricreducing antioxidant power, FRAP）和自由基抗氧化（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid, ABTS）3种方法对各品种果肉提取物的总抗氧化活性进行评价,并使用相关系数法分析抗氧化能力与多酚含量的相关性。【结果】结果表明,供试葡萄柚总酚含量变异范围为6.93-21.18 mg·g^-1 DW,‘四倍体马叙’葡萄柚的总酚含量最高;总黄酮含量变异范围为5.56-23.24 mg·g^-1 DW,‘四倍体马叙’的总黄酮含量最高。葡萄柚中的黄烷酮以柚皮苷和新橙皮苷为主,柚皮苷含量变异范围为1 180.58-3 065.33 μg·g^-1 DW,‘火焰’葡萄柚的柚皮苷含量最高,新橙皮苷含量变异范围为94.05-637.24 μg·g^-1 DW,‘鸡尾’葡萄柚的新橙皮苷含量最高。多甲氧基黄酮以橘皮素为主,其变异范围在0.56-4.66 μg·g^-1 DW之间,‘奥罗勃朗卡’的橘皮素含量最高。酚酸以没食子酸为主,其变异范围为60.42-385.53 μg·g^-1 DW,‘四倍体马叙’没食子酸含量最高。‘鸡尾’含有丰富的圣草次苷（111.23 μg·g^-1 DW）,‘马叙’含有丰富的橙皮苷（130.90 μg·g^-1 DW）,‘火焰’‘瑞红’‘四倍体马叙’和‘红马叙’含有丰富的没食子酸（＞300 μg·g^-1 DW）,‘鸡尾’含有丰富的绿原酸、咖啡酸和阿魏酸。供试葡萄柚的综合抗氧化指数（an overall antioxidant potency composite index, APCI）变异范围大,在36.70-97.50之间,除‘奥罗勃朗卡’和‘鸡尾’外,其他葡萄柚的APCI都比较高（＞80）。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素、橘皮素和绿原酸与果实抗氧化能力呈显著的正相关关系。【结论】中国主栽的9个葡萄柚品种多酚含量丰富,变异范围大,具有明显的组成和含量特点。柚皮苷、橘皮素和没食子酸是中国主栽葡萄柚的主要多酚类物质,各品种间多酚类物质的含量差异较大,抗氧化能力也有明显差异。‘火焰’‘瑞红’‘四倍体马叙’和‘红马叙’是没食子酸的良好来源,而‘鸡尾’是绿原酸、咖啡酸和阿魏酸的良好来源。总体上,在这些供试葡萄柚品种中,‘粉红汤姆逊’‘马叙’‘火焰’‘瑞红’‘四倍体马叙’和‘红马叙’不仅多酚含量极其丰富,而且抗氧化能力也高,是具有良好开发前景的天然抗氧化剂和保健食品及生物药品基料。     

紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株,通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定,获得转基因植株后,利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下,测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2 478 bp,编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性,模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达,其中在盐处理条件下,MsSIK1表达先升高后降低,在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时,MsSIK1受诱导表达增强明显,当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）;ABA处理时,MsSIK1被诱导表达明显,当处理3 h时表达量达到最大值,约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近,转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明,T₁代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高,且T₁-10中表达量最高;但在野生型中检测不到该条带,说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T₃-2、T₃-6、T₃-10转基因株系较野生型植株长势好,说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比,转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下,叶绿素含量下降较少,其中,野生型叶绿素含量降低了77%,T₃-3降低了53%,T₃-6降低了44%,T₃-10降低了35%;同样盐胁迫下,3个转基因株系的MDA含量积累较少,其中,野生型MDA的含量是T₃-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。     

干旱胁迫对转拟南芥Atpsy基因生菜的影响

干旱胁迫处理转拟南芥Atpsy基因的T1代生菜和野生型生菜,测定各转基因株系与野生型生菜的各项生理生化指标、目的基因的表达量和类胡萝卜素的含量。结果显示:正常情况下,转基因株系与野生型植株的各项生理指标之间没有明显的差异,随胁迫程度加深,转基因株系在发芽率、发芽指数和净光合速率的下降幅度方面小于野生型;同等胁迫强度下,转基因株系的脯氨酸、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶活性高于野生型植株;转基因株系植物体内丙二醛的快速积累程度和叶绿素降解速率小于野生型对照组。干旱胁迫处理下,转基因株系Atpsy基因的表达量和类胡萝卜素的含量均有所提高。     

麦角硫因抑制双孢蘑菇褐变及其与能量代谢关系

【目的】控制和降低运输与贮藏过程中的褐变是目前双孢蘑菇保鲜的重点。研究麦角硫因处理对双孢蘑菇采后褐变的抑制效果,进一步分析褐变与能量代谢关系,为控制褐变和延长其保质期提供科学依据和生产指导。【方法】对具有代表性的双孢蘑菇品种AS2796喷涂浓度为0.12 mmol·L^-1的麦角硫因溶液,对照组采用超纯水处理,于4℃低温下贮藏17 d,贮藏时定期测定其褐变度、菌盖白度、丙二醛含量（MDA）和能量相关物质（ATP、ADP、AMP含量）、能荷及琥珀酸脱氢酶（SDH）、细胞色素氧化酶（CCO）、H⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase等线粒体呼吸代谢相关酶活性。【结果】随着贮藏时间的延长,双孢蘑菇的褐变度和MDA含量逐渐增加,菌盖白度不断下降。与对照组相比,麦角硫因处理延缓了MDA含量和褐变度的上升及菌盖白度的下降,保护了细胞膜的完整性,降低了膜脂过氧化程度,有效抑制了双孢蘑菇菌盖表面及内部组织的褐变。贮藏过程中,双孢蘑菇的ATP含量呈现出先上升后下降的趋势,且始终维持在较高水平,最低点（贮藏第17天）也高于0.6 mg·g^-1。整个贮藏期间,双孢蘑菇的ADP和AMP含量逐渐上升,处理组的ATP和AMP含量显著高于对照组（P＜0.05),而ADP含量始终低于对照组。能荷值不断下降,但处理组双孢蘑菇的能荷值始终略高于对照组。表明麦角硫因处理延缓了双孢蘑菇采后ATP含量的下降,提高了ATP的利用效率,在一定程度上维持了较高的能荷水平。麦角硫因处理的双孢蘑菇SDH、H⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase酶活性显著高于对照组（P＜0.05),且CCO酶活性在贮藏前期（第5天）和贮藏末期（第17天）相较于对照组也有所提升,从而维持了更好的线粒体功能,保证了ATP的高效合成。【结论】麦角硫因处理明显抑制了双孢蘑菇采后褐变,且其对褐变的抑制作用与能量代谢密切相关。     

短时高温暴露对褐飞虱存活和生殖特性的影响

【目的】明确短时高温暴露对褐飞虱成虫存活和生殖特性的影响,为褐飞虱种群发生预测及防治提供理论依据。【方法】采集初羽化24 h内的褐飞虱成虫,辨别雌、雄后放入平底玻璃管内,每管5对,置于水浴循环仪中进行高温暴露处理,设置6个靶标温度,分别为33、35、37、39、39.5和40℃,误差范围0.02℃。高温处理时以25℃为起点温度,然后以0.1℃/min的速度上升至靶标温度,待靶标温度恒定后,在靶标温度下处理2 h。处理结束后,将褐飞虱转移到25℃的人工培养箱中,1 h后观察记录其存活情况,以未经过高温处理的褐飞虱成虫为对照。随后研究其存活率、产卵量及后代存活能力是否发生变化。【结果】33-37℃对褐飞虱雌、雄虫的存活率均无显著影响;而39-40℃下暴露2 h,雌、雄虫的存活率显著下降,其中39.5℃下暴露2 h,雌、雄虫存活率均低于50%,40℃下暴露2 h,雌、雄虫存活率仅为4.5%-6.7%,且成虫存活时间不足24 h;不同高温暴露2 h后,褐飞虱雄成虫逐日存活率曲线坡度较雌成虫陡;在35-39.5℃范围内暴露2 h,褐飞虱的产卵前期有所延长,尤其在39.5℃下暴露2 h,每头褐飞虱雌虫的平均产卵前期达6.3 d,与对照（25℃）的产卵前期3.5 d达到极显著差异水平（P＜0.01）;在35和39℃暴露2 h,产卵前期显著延长,分别达到4.4和4.4 d（P＜0.05）;高温暴露对褐飞虱雌成虫产卵量也有明显的影响,33、35、37、39及39.5℃分别暴露2 h,每雌产卵量显著从25℃的365.5粒下降至165.4、194.6、146.7、301.6和234.7粒（P＜0.05）;高温暴露对褐飞虱后代孵化率和性比均无显著影响,但对其后代总存活率有着显著的影响,随着温度上升,F₁代若虫总存活率由对照（25℃）的80.4%下降至61.8%-75.5%;褐飞虱成虫在33-39.5℃高温下暴露2 h,其F₁代若虫总存活率比对照均下降,而除35℃（75.5%）外,其他温度暴露后,均与对照存在显著差异（P＜0.05）,40℃下褐飞虱停止产卵活动。此外,高温暴露还能使褐飞虱的产卵节律和孵化节律发生变化,经39.5℃高温暴露2 h后,较33、35、37和39℃高温处理及对照的产卵高峰期和后代的孵化高峰期推迟。【结论】在39-40℃高温暴露下,褐飞虱成虫存活及产卵量和后代总存活能力显著下降,39℃及以上高温对褐飞虱存活与生殖具有一定的威胁。     

蓝光促进绿僵菌产孢和产孢调节基因fluG表达

【目的】明确蓝光照射对绿僵菌产孢的促进作用及与产孢调节基因fluG表达量的关系,为绿僵菌发酵生产提供光照促进产孢的理论依据和技术参数。【方法】以绿僵菌高效杀虫菌株M202为试材,平板接种培养,通过显微观察每隔12 h的菌体发育状态,确定菌株发育进程产孢前期、初始期、旺盛期、平稳期的对应时段。以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理在黑暗中培养至不同发育期即24、48、72 h的菌体,继续培养到产孢稳定期后,采用打孔法取样,以显微计数法检测计算产孢量,评估菌体发育阶段对蓝光的敏感性以及蓝光照射能量对产孢量的影响。克隆fluG,建立fluG real-time PCR反应体系;以蓝光6 804-54 432 J?m^-2的8个能量梯度,照射处理发育至48 h即处于产孢前将进入产孢期的菌丝体,照射处理后立即取菌丝,液氮冷冻,提取RNA并反转录成cDNA,通过real-time PCR检测fluG表达量,评估蓝光照射对fluG表达量的影响。【结果】绿僵菌M202菌株发育24 h前为萌发期,24-72 h为菌丝快速生长期,其中48 h还处于产孢前期,60 h已进入产孢初期,72-96 h为产孢盛期,96-120 h为产孢末期,120 h后为孢子成熟期,7-10 d后产量达到稳定。蓝光不同能量照射24 h菌龄即初期菌丝体,其产孢量与无光照处理的对照无显著差异,照射48 h菌龄即菌丝快速生长的产孢前期,其产孢量显著提高,最适照射能量为20 412-40 824 J?m^-2,其中34 020 J?m^-2使产孢量最高达无光照处理对照的1.50倍,72 h菌龄即产孢结构形成、产孢量快速增长期对蓝光最为敏感,低至6 804 J?m^-2的照射能量即可显著提高产孢量,且宽泛的各剂量均有效。对于fluG的表达,在试验照射剂量范围内,48 h菌龄接受蓝光照射后,fluG表达量显著提高,表达量随照射剂量呈先上升后下降的趋势,在20 412 J?m^-2以下较低能量时,fluG表达量与照射剂量成正相关,当照射时间为2.25 h时,表达量达到最高,为无光照处理对照的2.41倍,而在20 412 J?m^-2以上较高能量时,二者呈现负相关,随着蓝光照射时间的增加,基因表达量呈下降趋势;灰色关联度分析显示,当关联因子为0.5时,产孢量与fluG表达量的关联度r值为0.74。【结论】蓝光照射能够促进绿僵菌产孢及fluG表达,不同发育阶段的菌体对蓝光感应有显著差异,在48-72 h菌龄时照射34 020 J?m^-2能量可获得最高产孢量,产孢与fluG之间有较高关联度说明fluG参与绿僵菌产孢的调控。     

棉花PsbS基因对烟草光合特性的影响

【目的】分析光系统II PsbS基因在不同光照条件下,光系统II PsbS基因的功能 。【方法】利用转棉花PsbS基因的烟草(Nicotiana tabacum xanthin),T3代株系及非转基因(普通野生型,wt)烟草为材料,比较两者的生物学性状(叶面积、叶绿素含量)及在不同光强(75、240、450 μmol/(m²·s))下的生理(光合作用)性状。【结果】转基因植株前期叶面积增长较快,叶绿素组成成分的含量也存在差异,叶绿素a、b含量显著高于野生型烟草,转基因烟草具有更强的光合能力,并伴随着气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)提高。【结论】转PsbS 基因可以提高烟草光合能力。     

大斑刚毛座腔菌高产漆酶条件的响应面优化及酶学特性

【目的】优化大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）高产漆酶的最佳发酵条件,确定其酶学性质,为进一步开发应用奠定基础。【方法】以大斑刚毛座腔菌为出发菌株,首先采用单因素试验确定影响菌株产漆酶的碳源、氮源及铜离子的种类及范围,并在单因素试验的基础上,以漆酶酶活力为响应值,采用central composite design（CCD）响应面设计试验,利用Design Expert软件对响应值进行3因素3水平下的多元二次回归拟合分析,优化大斑刚毛座腔菌产漆酶的发酵培养基成分;初步分离大斑刚毛座腔菌发酵液中的漆酶,以ABTS为反应底物,设置不同温度及pH,测定漆酶的最适反应温度、pH及热稳定性、pH稳定性,进一步测定其反应动力学常数Km值、Vm值,确定其酶学特性。【结果】建立了以漆酶酶活力为响应值的多元二次回归模型,模型差异显著（P=0.0001）,可以用该模型来拟合试验;响应面分析结果表明,各因素对漆酶活力的影响大小依次为Cu²⁺>葡萄糖>尿素,而葡萄糖和尿素交互作用极显著;通过拟合求出模型极值点,对应的大斑刚毛座腔菌产漆酶的最佳培养条件为：葡萄糖50.05 g?L^-1,KH₂PO₄ 1 g?L^-1,尿素1.46 g?L^-1,MgSO₄ 0.5 g?L^-1,蛋白胨2 g?L^-1,玉米浆0.5 g?L^-1,CuSO₄ 0.07 g?L^-1,Tween80 3 mL?L^-1,28℃,150 r/min振荡培养7 d;在此条件下漆酶活力最高达（40.00±1.20）U?mL^-1。对大斑刚毛座腔菌漆酶发酵液初步分离,经SDS-PAGE检测其漆酶相对分子量约为80 kD;以ABTS为底物时,最适反应温度为50℃,最适pH为4.2,在温度较高且弱酸性条件下活性较高,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,常温下pH为4.2保持14 h后酶活力基本不变,50℃保温14 h后漆酶活力仍保持在60%以上;进一步在常温、pH为4.2时测定其米氏常数Km值为0.036 mmol?·L^-1,最大反应速率Vm为28.63 mmol?L^-1?min^-1。【结论】利用大斑刚毛座腔菌液体发酵产漆酶并研究其酶学特性,表明作为玉米致病菌的大斑刚毛座腔菌产漆酶具有发酵周期短、活性高、稳定性好等特性,可进一步研究开发应用。     

环介导等温扩增（LAMP）技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。【方法】根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3 (5′-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3′)、A.apis-B3 (5′-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3′)、A.apis-FIP (5′-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3′)和 A.apis-BIP (5′-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3′),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg²⁺终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1, dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1, 内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol?L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV）、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8 μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1 Mg²⁺、1.2 mmol·L^-1 dNTPs、1.6 mmol·L^-1 FIP/BIP、0.4 mol·L^-1甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、0.2231×10^-5 μg·μL^-1作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^-6 μg·μL^-1。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。     

意大利蜜蜂工蜂幼虫饲料中适宜色氨酸水平

【目的】研究意大利蜜蜂（Apis mellifera）工蜂幼虫饲料中适宜色氨酸水平,为探明意大利蜜蜂工蜂幼虫发育阶段的色氨酸营养需要提供理论依据。【方法】选用1日龄工蜂幼虫1 008只,随机分为7组,每组3个重复,每个重复48只幼虫,分别饲喂色氨酸水平为7.84、8.84、9.84、10.84、11.84、12.84和13.84 mg?g^-1 的7种日粮。取5日龄工蜂幼虫虫体测定色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase,TPH）基因与5羟色胺受体（5-hydroxytryptamine receptors, 5-HTR）1、2α、2β、7基因表达量;取6日龄工蜂幼虫虫体测定总蛋白、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）;取6日龄工蜂幼虫血淋巴测定其中游离色氨酸水平;7日龄时,统计工蜂化蛹率;取9日龄工蜂蛹测定色氨酸体沉积量,统计21日龄工蜂出房数目,计算羽化率。【结果】色氨酸水平为10.84 mg?g^-1时,6日龄工蜂化蛹率最高,6日龄工蜂幼虫虫体蛋白含量最高,9日龄工蜂蜂蛹色氨酸体沉积最多,21日龄工蜂羽化率最高。色氨酸水平为10.84-11.84 mg?g^-1时,5日龄工蜂幼虫TPH基因表达量最高,5日龄工蜂幼虫5-HT受体1、2α、2β基因表达水平最高,6日龄工蜂幼虫血淋巴游离色氨酸含量最高。5日龄工蜂幼虫5-HT受体7基因表达量在色氨酸水平为7.84-11.84 mg?g^-1时,处于较低水平,12.84-13.84 mg?g^-1时显著高于其他水平（P＜0.05）。6日龄工蜂幼虫MDA含量在色氨酸水平为7.84-11.84 mg?g^-1时较低,12.84-13.84 mg?g^-1时含量显著高于其他水平（P＜0.05）。6日龄工蜂幼虫T-AOC在色氨酸水平为7.84-9.84 mg?g^-1时处于较低水平,10.84-11.84 mg?g^-1时处于较高水平,12.84-13.84 mg?g^-1时显著高于其他水平。【结论】意大利蜜蜂工蜂幼虫饲料适宜色氨酸水平为10.84-11.84 mg?g^-1。     

甘薯块根可溶性糖组分特征及其与食味的关联分析

【目的】可溶性糖含量是甘薯块根食用品质和加工性能的重要指标,研究可溶性糖组分特征及其与食用品质的关系,有助于了解块根可溶性糖组分在加工中的变化及其对食味的影响,为甘薯鲜食与加工的品种选择、专用品种选育和种质资源利用提供依据。【方法】采用高效液相色谱蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）测定102份甘薯种质资源的生薯和蒸熟薯的可溶性糖组分含量,对不同干物率类型的块根可溶性糖组分特征进行分析,并用相关性和逐步线性回归分析可溶性糖组分与食味的关系及其对食味的贡献。【结果】甘薯的生薯和熟薯均含有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖4种可溶性糖。在生薯中,蔗糖含量最高,平均含量为25.79 mg·(g·FW)^-1,占生薯可溶性糖的45.31%;果糖和葡萄糖含量相近,关系密切,果糖含量（y）和葡萄糖含量（x）的拟合方程为y=0.807x+1.275;麦芽糖含量最低,平均含量为6.79 mg·(g·FW)^-1,仅占生薯可溶性糖的11.92%。生薯可溶性糖含量高低主要由果糖和葡萄糖含量决定,通常情况下,低干物率品种具有更高的生薯可溶性糖和果糖含量,生化甜度更好。在蒸熟过程中块根中可溶性糖含量变化主要在于产生了大量麦芽糖,麦芽糖含量从生薯的0.96—24.67 mg·(g·FW)^-1提高至14.80—136.16 mg·(g·FW)^-1。熟薯可溶性糖含量高低是由麦芽糖含量决定的,中、高干物率类型具有更高的熟薯可溶性糖和麦芽糖含量。甘薯块根食味增量主要来源于蒸熟过程中产生的可溶性糖;麦芽糖、果糖、蔗糖是甘薯块根食味的重要影响因子;麦芽糖对食味增量的贡献率近50%,对香味和质地的作用尤为突出;果糖对黏度的贡献最大,而蔗糖对质地的贡献优于果糖。【结论】生薯可溶性糖和果糖含量是反映甘薯生薯甜度的重要指标,熟薯可溶性糖、麦芽糖含量是反映甘薯食味的重要指标。麦芽糖、果糖、蔗糖是影响甘薯块根食用品质及加工性能的重要可溶性糖组分。筛选出甘薯块根可溶性糖特异种质11份。     

黑穗醋栗果实生长发育过程中抗坏血酸含量 及相关酶活性的变化

【目的】 研究不同品种不同生长时期黑穗醋栗果实内抗坏血酸（AsA）含量及其合成代谢过程中相关酶活性的变化,以明确果实生长发育过程中AsA含量与代谢合成相关酶之间的关系,为全面揭示黑穗醋栗果实AsA积累规律提供理论依据。【方法】 以3个不同黑穗醋栗品种（‘亚德’‘布劳德’和‘黑丰’）为试材,测定果实在幼果期、膨大期、半转色期、转色期和成熟期时还原型抗坏血酸（AsA）、氧化型抗坏血酸（DHA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及AsA合成与代谢相关酶活性。【结果】 不同品种黑穗醋栗果实大小、AsA含量以及AsA相关代谢物水平存在明显的多样性。其中‘亚德’单果重最大,为1.97 g。果实生长发育过程中,总抗坏血酸（T-AsA）和AsA含量在3个品种中变化趋势一致,均在幼果期含量最高,其中‘亚德’幼果期果实中AsA含量最高,为83.17 μmol·g ^-1 FW,随着果实的生长迅速下降,在成熟期降至21.28 μmol·g ^-1 FW;3个品种果实中GSH和T-GSH含量随着果实发育呈升高趋势,但不同品种升高时期或增加幅度不同;GSSG含量在不同品种间存在较大差异,成熟果中‘黑丰’含量最低,为0.008 μmol·g ^-1 FW,仅为‘亚德’的10.2%。AsA-GSH循环再生代谢中,脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性在果实膨大期达到最高,成熟期降至最低,其中‘布劳德’果实中DHAR和MDHAR活性略高于‘亚德’和‘黑丰’;谷胱甘肽还原酶（GR）活性在幼果期最高,‘亚德’幼果期果实中GR活性最高（0.06 μmol·min ^-1·g ^-1 FW）,之后随着果实的生长发育不断下降,抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性变化与之相似;L-半乳糖途径的关键酶L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶（GalLDH）活性随着果实生长发育的变化趋势与AsA含量变化相一致,且‘亚德’果实中GalLDH活性在幼果期和成熟期均高于其他两个品种。通过相关性分析发现,GalLDH与T-AsA、AsA、DHA、DHAR和MDHAR呈现极显著正相关关系,相关系数可达0.91以上,即果实中GalLDH活性越高,果实中AsA含量也越高;DHAR和MDHAR与T-AsA、AsA间也存在极显著正相关关系,而APX与T-GSH、GSH间相关性较强。【结论】 黑穗醋栗幼果期果实中AsA含量最高,且品种间差异显著;GalLDH、MDHAR和DHAR可能是黑穗醋栗果实中AsA合成代谢的关键酶,黑穗醋栗果实中AsA含量积累主要取决于GalLDH活性,说明合成途径起着更关键的作用,而AsA-GSH循环再生途径相关酶对AsA合成也有一定的贡献,黑穗醋栗高AsA含量的积累是由合成途径与循环途径共同作用的结果。