绵羊卵丘细胞直径与卵母细胞质量的相关性

利用RT-PCR方法,检测不同直径绵羊卵泡卵丘细胞中FSHR、EGFR、GHR、b FGF、CYP19A、AMH基因的mRNA表达规律及卵母细胞孤雌激活后胚胎发育的影响,结果表明,大、中、小卵泡卵丘细胞中都有FSHR、EGFR、GHR、b FGF、CYP19A、AMH的mRNA表达,不同直径卵泡卵丘细胞呈现递增趋势,大卵泡卵丘细胞与中小卵泡的卵丘细胞相对表达量差异显著(P0.05);AMH在直径5.0 mm的卵泡卵丘细胞中有所下降。不同大小卵泡卵母细胞经体外培养,结果表明,各卵泡卵母细胞直径组间成熟率不显著,随卵泡直径的增大卵裂率增加,1.0~2.0 mm组与2.1~5.0 mm组卵裂率都显著低于5 mm组(P0.05),相互间无差异(P0.05);囊胚率也呈现逐渐增加的趋势,卵泡大于5.0 mm卵母细胞组极显著高于1.0~2.0 mm组(P0.01),2.1~5.0 mm组(P0.05)。证实卵丘细胞在绵羊卵母细胞成熟和受精及随后的胚胎发育过程中起重要作用,卵泡直径对卵母细胞发育能力产生影响。     

组织切片法观察昆明白小鼠卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系

三实验应用组织切片法探讨了体内正常生理条件下昆明白小鼠卵巢内卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系。初情期前小鼠注射孕马血清促性腺激素,４８ｈ后注射人绒毛膜促性腺激素,于注射ＨＣＧ后不同时间取出卵巢进行组织切片。注射ＨＣＧ后１ｈ,卵丘细胞开始扩展,此时卵母细胞核膜完整,即未发生生发泡破裂;注射ＨＣＧ后３ｈ,大部分大有腔卵泡中卵母细胞发生ＧＶＢＤ,此时卵丘处于２级扩展状态。卵丘完全扩展发生在注射ＨＣＧ后９ｈ,     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

牦牛卵泡发育过程中卵丘卵母细胞复合体的转录组分析

为探讨牦牛有腔卵泡发育过程中卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)mRNA转录组变化,对牦牛小(2~3 mm)、中(4~5 mm)、大有腔卵泡(6~8 mm)中的COCs进行Illumina平台测序,筛选差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),并进行GO分析和KEGG分析。结果表明,1)牦牛小、中、大3个阶段的卵泡COCs中共有17 342个基因表达;2)小卵泡与中卵泡COCs之间有879个DEGs,其中,上调435个,下调444个;DEGs注释到106条GO条目,其中生物过程(BP)类别46条,细胞组成(CC)类别25条,分子功能(MF)类别35条,涉及254条KEGG通路。中卵泡与大卵泡COCs之间有1 560个DEGs,其中,上调590个,下调970个;3)DEGs注释到114条GO条目,其中BP 55条、CC 26条和MF 33条,涉及276条KEGG通路,DEGs主要富集在神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞粘附分子、钙离子信号通路和cAMP信号通路等重要通路。综上,牦牛卵泡在不同发育阶段的DEGs、GO条目和KEGG pathway存在明显差异,为揭示牦牛卵泡发育分子调控机制,改善牦牛卵母细胞体外成熟技术提供了理论依据。     

卵丘细胞和细胞骨架稳定剂对绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

[目的]为了提高绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻的效果。[方法]以未冷冻的卵母细胞为对照,研究卵丘细胞存在与否以及不同浓度的细胞骨架稳定剂对绵羊成熟卵母细胞冷冻保存的影响。[结果]卵丘细胞存在与否对绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻没有影响。在所有细胞松弛素B处理组中,用7.5、10.0μg/ml细胞松弛素B处理的绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后获得较高的囊胚率(P<0.05),分别为8.1%、7.8%;在所有紫杉醇处理组中,用0.5μmol/L紫杉醇处理的绵羊成熟卵母细胞玻璃化冷冻后获得的囊胚率最高为10.1%(P<0.05)。[结论]细胞骨架稳定剂细胞松弛素B或紫杉醇可以提高绵羊成熟卵母细胞的玻璃化冷冻效果。     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卵中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

 【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术(RT-PCR),对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

月份对绵羊卵母细胞采卵数及体外成熟的影响

为研究不同月份对绵羊卵母细胞采卵数及体外成熟的影响,采用切割法获得不同月份绵羊卵母细胞,统计分析可用卵母细胞数和体外培养成熟率。结果表明:随着月份的延续,卵母细胞获得数从5月的(3.53±0.27)(个/d)稳步增加到11月的(5.16±0.15)(个/d),差异极显著(P<0.01)。卵母细胞体外成熟率也显著提高,其中8月份成熟率极显著高于5月、6月、7月(P<0.01);9月、10月、11月卵母细胞成熟率又极显著的高于8月(P<0.01),同时季节和气温对绵羊卵母细胞采卵数和利用也有显著影响(P<0.01)。因此,不同月份采卵显著影响可用绵羊卵母细胞数和卵母细胞体外成熟水平。     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卯中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术（RT—PCR）,对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

组织切片法观察昆明白小鼠卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系①

本实验应用组织切片法探讨了体内正常生理条件下昆明白小鼠卵巢内卵丘扩展与卵母细胞成熟的关系。初情期前小鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG）,48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）,于注射HCG后不同时间取出卵巢进行组织切片。注射HCG后1 h,卵丘细胞开始扩展,此时卵母细胞核膜完整,即未发生生发泡破裂（GVBD）;注射HCG后3 h,大部分(＞70%)大有腔卵泡中卵母细胞发生GVBD,此时卵丘处于2级扩展状态。卵丘完全扩展发生在注射HCG后9 h,而PB1的排出是从12　h开始的。结果表明在小鼠体内,卵丘开始扩展先于卵母细胞成熟,但卵母细胞成熟并不需要卵丘完全扩展;促性腺激素能促进卵泡发育及卵母细胞成熟,同时也具有促使卵泡退化的功能。     

绵羊UCP4基因编码序列的克隆和mRNA表达研究

【目的】克隆绵羊UCP4基因的编码序列（CDS）,分析CDS及其编码蛋白结构特点,并探讨其mRNA的发育性表达规律,以期为该基因的结构和功能研究奠定理论基础。【方法】利用RT-PCR技术从绵羊大脑组织中扩增出该基因的编码区序列,运用生物信息学方法分析UCP4蛋白的理化性质和结构特点。利用实时荧光定量PCR技术,对两个具有显著尾型差异的绵羊品种（广灵大尾羊和小尾寒羊）2、4、6、8、10和12月龄共计96个个体的8种组织（大脑、小脑、下丘脑、垂体、皮下脂肪、肾周脂肪、肠系膜脂肪和尾部脂肪）进行mRNA表达研究。【结果】绵羊UCP4基因CDS区长972 bp,编码323个氨基酸,分子量为35.73 kDa,等电点为9.43。二级结构中α螺旋、β折叠股和环分别占56.04%、7.12%和36.84%。该蛋白为跨膜蛋白,无信号肽,但有2个糖基化位点和15个潜在的磷酸化位点。UCP4 mRNA在脑组织和脂肪组织中均有表达,但高表达于脑组织中。品种、月龄和组织对UCP4 mRNA表达均有显著影响。【结论】获得了绵羊UCP4 基因的CDS全序列,揭示了其mRNA的表达特征及其影响因素,对进一步研究该基因的结构及其与能量代谢的关系具有重要科学意义。     

一串红组培快繁技术

本试验以一串红茎段为试验材料,以NAA,6-BA为主要研究因子,进行一串红组培快繁技术的研究。试验得出一串红最佳芽分化培养基为MS 0.1mg/LNAA 0.5mg/L6-BA;最佳增殖培养基为MS 0.1mg/LNAA 2mg/L6-BA;最佳生根培养基为1/2MS 0.2mg/L IBA。     

绵羊肌内前体脂肪细胞CNR1和FABP4基因表达研究

为研究绵羊脂肪细胞增殖分化过程中参与动物能量代谢调控的大麻素受体1（cannabinoid receptor 1）基因CNR1和调控脂肪沉积的脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4）基因FABP4的表达规律和差异,采集一只3日龄湖羊羔羊背最长肌组织,背肌组织经Ⅱ型胶原酶消化后分离观察原代前体脂肪细胞;开展前体脂肪细胞培养并绘制生长曲线;应用胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导前体脂肪细胞后,采用油红O染色观察成熟脂肪细胞形态;收集不同分化时间点细胞,应用实时荧光定量PCR方法测定CNR1和FABP4基因表达量。结果表明,羔羊背最长肌组织成功分离出了前体脂肪细胞,贴壁细胞呈梭形;诱导前体脂肪细胞经油红O染色后观察到脂滴形成,具有脂肪细胞特征;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化早期均较低,但在诱导分化中后期表达量逐步升高;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化后的第2、第4和第8天均差异不显著,但FABP4基因在第12天的表达量显著高于CNR1基因。上述结果为进一步探究绵羊CNR1和FABP4基因调控关系及利用两基因改良绵羊肉品性状提供了参考数据。     

绵羊RARG基因在发情不同阶段卵巢中的mRNA表达

【目的】分离鉴定绵羊视黄酸受体-γ（Retinoic acid receptor gamma,RARG）基因,分析该基因的分子特征,研究其在发情周期不同阶段卵巢中的表达差异。【方法】选取年龄和体况相近、健康的甘肃高山细毛羊周岁母羊8只,通过同期发情处理,根据卵巢生理状态,将其分为两组：黄体期组和卵泡期组,各4只,屠宰后,采集卵巢组织,以周岁母羊卵巢组织RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增绵羊RARG基因并克隆到pMD18-T载体中进行测序验证。利用ORF Finder和DNAStar等生物信息学软件分析绵羊RARG基因的理化性质、同源性和预测结构域和功能。利用Q-PCR技术,检测绵羊RARG基因在母羊发情周期不同阶段卵巢组织中的相对表达量,用SPSS19.0软件进行差异显著性分析,探讨RARG基因对绵羊发情周期的调控机制。【结果】获得了绵羊RARG基因包含完整编码区序列在内的1 588 bp的绵羊RARG基因序列,并提交至NCBI,GenBank登录号为KF019682。该序列含有1个1 377 bp的完整开放阅读框（Open reading frame,ORF）,编码458个氨基酸,其蛋白分子质量为50 955.8 D,理论等电点为7.45。绵羊RARG基因与牛、普通狨、家犬、仓鼠、家猫、人、小鼠、虎鲸、狒、家鼠、野猪、海牛、海豚和蟾蜍等14个物种的同源性分析,结果显示RARG基因在上述物种间高度保守,且与牛的亲缘关系较近,序列同源性最高。GO功能分析结果显示,绵羊RARG基因作为结构蛋白参与转录调控的几率最高,分别为0.272和0.223。在绵羊RARG基因编码的氨基酸序列上发现了2个功能结构域,分别是核激素受体c4锌指结构域（c4 zinc finger in nuclear hormone receptors,ZnF_C4）和 激素受体配体结构域（ligand binding domain of hormone receptors,HOLI）。Q-PCR结果显示,绵羊RARG mRNA 在甘肃高山细毛羊卵泡期卵巢中的相对表达量显著高于黄体期（P<0.05）。【结论】绵羊RARG基因在物种间高度保守,含有ZnF_C4和HOLI等2个与转录调控相关的功能结构域,推测该基因可能作为一种重要的转录因子参与母羊发情周期调控。     

石蜡切片制片技术的探讨

石蜡切片的制作是组织学和病理学中常用的一种方法。常规制作切片的方法,往往达不到满意的效果。本文根据作者十年的制片经验,摸索其药品的配制,对实验步骤和操作方法等细节方面进行了改良,大大的提高了切片的染色效果和整体质量,明显降低脱片率(低于5%)。     

从绵羊脂肪组织提取总RNA方法的改进及应用

以绵羊脂肪组织为材料,对脂肪组织总RNA提取方法进行了改进,并分析了脂肪酸合成酶基因(fattyacid synthase,FAS)在绵羊腹部皮下脂肪组织、肠系膜脂肪组织和尾部脂肪组织中表达的差异性.结果表明:利用改进后的方法从绵羊脂肪组织中提取出的RNA无DNA污染、均一、完整、质量可靠.绵羊腹部皮下脂肪中FASmRNA的表达量极显著高于尾部脂肪组织和肠系膜脂肪组织(P<0.01),且尾部脂肪组织和肠系膜脂肪组织中FAS mRNA的表达量差异不显著(P>0.05).     

绵羊UCP1基因碱基突变与其蛋白结构和功能

【目的】检测两个绵羊群体中解偶联蛋白1（uncoupling protein 1,UCP1）基因的单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism,SNP）,预测和分析碱基改变对蛋白结构和功能的影响。【方法】利用PCR-SSCP结合测序的方法检测UCP1基因编码区的SNPs,用生物信息学方法分析UCP1蛋白的理化性质和结构。【结果】UCP1基因编码区存在4个SNPs,其中c.214G＞A（Val72Met）和c.273C＞T位于外显子2,c.624C＞T和c.757G＞A（Ala253Thr）位于外显子5。进一步分析导致氨基酸改变的c.214G＞A和c.757 G＞A突变发现,此两个突变只对UCP1蛋白的理化性质和转录因子结合位点有细微改变,未引起UCP1蛋白空间构象的变化,对蛋白表达的影响不大。【结论】基于对人类中两个与肥胖相关的外显子突变型蛋白结构的比较说明,UCP1蛋白结构的改变可能影响其功能。     

文冠果成熟胚离体培养及细胞学研究

以文冠果成熟胚为外植体,进行了初代培养、继代培养和生根培养研究,结果表明:初代培养诱导文冠果成熟胚形成不定芽的适宜培养基是MS+2.0mg.L-16-BA+0.1mg.L-1NAA+30g.L-1蔗糖+6g.L-1琼脂,分化率可达94.7%;继代高生长的适宜培养基是MS+0.5mg.L-16-BA+0.5mg.L-1NAA+30g.L-1蔗糖+6g.L-1琼脂,培养50d后,苗高大于0.5cm芽数量平均达11.67株;生根培养的适宜培养基是WPM+1.0mg.L-1IBA+30g.L-1蔗糖+6g.L-1琼脂,生根率为70.30%,平均根数为3.57条。并通过石蜡切片技术,观察愈伤组织诱导、愈伤组织分化不定芽以及不定芽发育过程。     

中国美利奴成母羊促甲状腺激素受体基因的克隆与组织表达

[目的]探讨绵羊TSHR基因序列及组织表达特征,为进一步研究TSHR在绵羊季节性繁殖中作用的分子机理奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术克隆绵羊TSHR基因,并对序列进行生物信息学分析;采用半定量RT-PCR技术检测TSHR在绵羊不同组织的表达情况.[结果]以中国美利奴羊卵巢组织cDNA为模板,获得了3 276 bp的TSHR cDNA序列,包括全部编码区序列(Coding Sequence,CDS)长2 295 bp,编码764个氨基酸.TSHR蛋白结构经预测发现存在多个磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点.半定量RT-PCR结果显示,绵羊TSHR基因在所检测组织中均有表达,其中在下丘脑、松果体和垂体中呈高丰度表达,在甲状腺、子宫等组织呈中等丰度表达.[结论]从绵羊卵巢组织中克隆到TSHR基因并进行了序列分析;TSHR基因在绵羊各组织中广谱表达,但在下丘脑、松果体、垂体、甲状腺中表达水平较高,提示TSHR在绵羊季节性繁殖等重要生理活动的神经内分泌调节过程中发挥重要作用.