柑橘栽培品种（系）DNA指纹图谱库的构建

 【目的】构建柑橘栽培品种（系）的DNA指纹图谱数据库,为建立柑橘种苗纯度及真实性鉴定技术体系和技术规范奠定基础。【方法】利用SSR标记和ISSR标记对102个柑橘栽培品种（系）进行DNA指纹分析,筛选适合的特征引物,构建柑橘栽培品种（系）的指纹图谱数据库。【结果】从200对SSR引物中筛选到重复性好、多态性丰富的12对引物作为柑橘品种（系）鉴定的特征引物,12对SSR特征引物组合可鉴别42个品种（系）;在此基础上,对未出现SSR特征指纹的60个品种（系）进行ISSR指纹分析,从40个ISSR引物中筛选到2个可用于品种鉴定的特征引物,结合SSR标记,可快速、准确地鉴别70个柑橘的品种（系）。并利用这12对SSR特征引物和2个ISSR特征引物构建了70个柑橘栽培品种（系）的DNA特征指纹图谱数据库。【结论】SSR和ISSR标记适于构建柑橘栽培品种DNA指纹图谱库;指纹图谱库的建立为柑橘种苗纯度及真实性鉴定奠定了基础。     

基于SSR构建中国主栽草莓品种指纹图谱

【目的】利用SSR分子标记构建中国主栽草莓品种的DNA指纹图谱,为保护育种者权益和实现草莓资源的高效鉴定提供基础数据。【方法】以中国目前主栽的草莓品种(70个)为材料,采用荧光毛细管电泳技术对28个SSR分子标记进行评估,利用筛选后的高效SSR标记构建草莓品种的DNA指纹图谱。【结果】从28对引物中选出了5对多态性较高、重复性较好的核心引物。核心引物共检测出40个等位位点,平均每对引物检测出8个等位位点;共检测到142个带型,平均每对引物检测出28.4个带型;各标记的多态信息含量(PIC)为0.79～0.87,平均PIC值为0.83;聚类分析结果表明,草莓品种之间的相似系数范围为0.65～0.97。【结论】成功构建了具有唯一对应关系的70个草莓品种的DNA指纹图谱,为未来草莓品种的资源保护和利用推广提供数据支撑。     

20个花生品种的SSR标记指纹图谱构建

为了保护农民以及育种者的利益,发展稳定可靠的品种鉴定方法具有重要意义。对南方花生主产区20个品种进行了SSR标记指纹图谱研究,从64对SSR标记引物中筛选出4对构建了20个花生品种的指纹图谱,该图谱能使19个品种相互区分。     

中国玉米审定品种标准SSR指纹库的构建

【目的】对数量庞大的已知玉米品种构建可共享的作物品种标准DNA指纹库。【方法】基于荧光毛细管电泳检测平台和植物品种DNA指纹库管理系统,利用筛选的40对SSR核心引物对3 998份中国玉米审定品种标准样品进行建库,通过多实验室、多检测平台进行建库数据的质量评估。【结果】绘制了40个玉米建库引物的等位基因频率分布图作为每个引物的特征图谱,在建库试验中发挥了相当于参照样品的作用。形成了一套十重荧光毛细管电泳组合,并在SSR指纹分析器中建立了一套系统默认PANEL作为不同实验室建库时的标准PANEL。统计玉米审定品种指纹库构建的试验情况,每份样品具有2—5套原始试验数据及对应的指纹图谱,其中61%的样品做了2组独立试验,33%的样品做了3组独立试验,最终建成的标准指纹库累计缺失和差异位点仅占0.2%,数据完整性达到99.8%。在不同实验室、不同电泳检测平台的评估结果表明,同一荧光电泳检测平台上获得SSR指纹数据一致性高,而不同的电泳检测平台获得的数据存在一定偏差,为实现不同实验室的SSR指纹数据共享,需要统一荧光引物、分析软件及电泳检测平台。对所有审定品种指纹数据进行整体两两比较,表明中国玉米审定品种之间差异比较大,品种间差异位点百分比集中在80%—95%(占78.28%),品种间差异位点百分比在50%以上的已达到99.21%,而低于20%的只有0.09%;对玉米审定品种杂合率水平进行分析,平均品种杂合率达到64%,主要集中在50%—80%(占89%)。通过玉米品种标准指纹比对服务平台(网址:http://www.maizedna.org/)实现了指纹库的共享。【结论】形成了构建作物品种SSR指纹库的标准化程序,构建了3 998份玉米审定品种的SSR指纹库,通过多实验室联合比较试验,保证建库数据的准确性和数据库的可共享性;建立了玉米品种标准指纹比对服务平台网站,实现玉米审定品种指纹库在全国种子检验系统的共享。     

甘薯品种鉴定中指纹图谱的建立和应用

应用RAPD分析技术体系,构建了甘薯品种的指纹图谱.结果表明,在20μLPCR反应体积中,含有10mmol·L-1Tris-HCl(pH8.3)、50mmol·L-1KCl、2.5mmol·L-1MgCl2、100μmol·L-1dNTP、0.3μmol·L-1引物、40ng模板、1.5UTaq酶的反应体系适合甘薯RAPD分析.利用上述甘薯RAPD分析的指纹图谱,鉴定了10个供试品种.     

利用SSR分子标记建立杂交水稻指纹图谱

利用微卫星标记对大穗稻1126进行了DNA指纹图谱构建和品种鉴定的研究,77对引物中具有多态性的引物共36对,占所用引物的46．75％。利用这些SSR引物建立了1126的DNA指纹数据库,可以有效解决杂交水稻亲本1126的真伪性及与其他品种的区分问题。三组引物RM21、RM505、RM212共同扩增可以很好地将1126与其亲本Lemont与蜀恢527区分开来,可作为大穗稻1126的特征引物加以鉴定。由此可见利用微卫星分子标记技术进行水稻种子质量鉴定应用前景广阔。     

引进观赏芍药新种质的SSR指纹图谱构建

采用SSR标记构建从欧美等地区引进、收集的61份观赏芍药新种质的指纹图谱。根据引物的多态性信息含量和Shannon遗传多样性指数大小,从15对候选引物中筛选出10对多态性高且稳定性好的引物作为核心引物,首次构建了61个观赏芍药新种质指纹图谱,并编制了指纹代码。结果表明:被试种质资源的倍型丰富,有一条带、两条带,甚至出现了三条带、四条带;所绘制的图谱能够将所有品种(种)完全区分开。     

利用DNA指纹图谱进行农作物品种鉴定的研究进展

阐述了利用DNA指纹技术(如RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR和STS等)进行品种鉴定的原理、特点及其研究概况.与形态学鉴定、同工酶鉴定相比,DNA指纹技术是通过检测DNA水平上的差异来鉴定品种,具有准确、可靠、不受环境因素影响、且可鉴定表型上难于鉴别的品种等优点.DNA指纹技术简单、快速、易于自动化,因而它在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景.     

基于SSR技术的水稻DNA指纹图谱构建

水稻是我国重要的粮食作物,具有种植面积大、分布范围广等特点,然而由于水稻的遗传基础比较狭窄,在新品育种、品种区分及质量监控等方面经常出现问题。SSR技术作为第二代分子标记的典型代表,具有标记数量丰富、定位精准等优点,在水稻SSR指纹图谱的构建中提到不可替代的重要作用。该文主要综述了基于SSR技术构建的水稻DNA指纹图谱,对其技术要点及其构建意义进行分析,并对其发展趋势进行展望。     

基于SSR分子标记的福建百香果品种（系）鉴定及指纹图谱构建

【目的】基于SSR分子标记鉴别福建百香果品种的遗传多样性,构建福建百香果品种的分子指纹图谱。【方法】基于转录组测序,开发西番莲SSR分析标记,并筛选出15个重复性好、多态性高的分子标记用于17个福建百香果品种（系）鉴定及遗传多态性分析,构建百香果品种（系）的SSR分子指纹图谱。【结果】利用MISA软件对1 kb以上的24 319条西番莲（Passiflora caerulea L.） Unigene进行搜索,于8 742条Unigene上检测出11 385个SSR位点,出现频率为46.82%,平均分布距离为7.15 kb。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸分别占总SSR的63.72%、20.40%和14.28%,为数量较大的优势重复基序,其优势重复基元分别为A/T、 AG/CT和AAG/CTT。通过Primer 3.0共获得出28 257对SSR引物。从26对有效扩增引物中选择重复性好的15对引物,对17份百香果品种（系）进行多态性验证分析。15对SSR引物共产生235条多态性条带,PIC平均值为0.95。利用UPGMA进行聚类分析并作图,在遗传距离0.765处,可将17个品种（系）分为7个...     

基于SSR荧光标记的79份桃种质遗传多样性分析

【目的】利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对取自国家果树种质南京桃资源圃的79份种质进行基因分型和遗传多样性分析,筛选出多态性高的引物可用于桃品种间鉴定、亲缘关系分析,并用于分子标记辅助选种体系建立。【方法】对母本‘中油4号’进行从头测序,以物理距离1 Mb为单位在全基因组范围内开发SSR标记。以79个桃品种为材料进行PCR扩增,扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后筛选目标条带清晰且多态性丰富的标记。对筛选出的标记进行5′端荧光修饰,PCR产物在ABI3730XL测序仪测序,实现对标记的复筛。利用Genemapper 4.0软件对测序结果进行统计,Data Formater 2.1软件将统计得到的bp数据转换成Power Marker v3.25软件所需要的数据格式。对筛选出的引物进行多态性分析,选择多态信息含量（PIC）大于0.45的荧光SSR引物作为79份种质材料的核心引物。以Nei’s为参数,利用NTSYSpc 2.1软件中的UPDM聚类方法分析品种间的遗传多样性。利用基于贝叶斯模型的Structure v2.3.4软件解析79份种质的居群遗传结构。【结果】基于79份种质,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对覆盖全基因的SSR标记进行初筛,共筛选出207对多态性良好的引物;利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对207对引物进行复筛,最终筛选出26对核心引物,利用其中5对核心引物可将79份品种完全区分开。26对SSR核心引物在79份桃种质中共扩增出174种多态性基因型,每对引物扩增出的基因型为4—13种,平均每对引物扩增出6.69个基因型,每对引物的多态信息含量PIC在0.45以上。基于207对SSR引物在79份种质中扩增出的位点信息,构建了79份种质的遗传关系图谱和居群遗传结构图。207对引物从遗传距离上将79份种质划分为7组,从居群结构上分为2组。79份品种遗传多样性较高,部分品种聚类结果与系谱图相符。【结论】构建了79份材料的聚类分析图和居群遗传结构图,在一定程度上揭示了79份材料的亲缘关系。由于桃复杂的遗传背景,不能依据单一特性对品种间亲缘关系进行判定。本研究筛选出的26对核心引物可用于全基因组范围内连锁性状的鉴定、桃种质资源鉴定、新品种鉴定及保护、分子标记辅助育种体系构建。     

油菜杂交种合油杂2号纯度鉴定的SSR引物筛选

以陕西渭北旱塬最新审定的双低油菜品种合油杂2号以及亲本为试验材料,用SSR标记技术研究杂种与双亲之间的扩增谱带多态性以甄别真假杂种。结果发现,200对SSR引物先用亲本进行预选,有45对引物可以特异区分两亲本,进一步反复筛选,其中引物CB10524分别在杂交种和其双亲之间存在扩增条带的多态性,表现为杂交种条带均为父母本的互补型,很适合做杂交种纯度鉴定。用该引物对合油杂2号杂交种进行SSR纯度鉴定,所测纯度分别为93%,与田间实测纯度94.27%非常接近,表明开发的SSR标记技术在合油杂2号油菜杂交种子纯度室内快速检测中具有广阔的应用前景。     

一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的筛选

为了对山杨的幼苗进行早期的性别鉴定,通过寻找与杨属性别染色体相关的分子标记,试着鉴定山杨的雌雄。采用SSR结合BSA技术对96个山杨个体(雌性各48个)进行性别差异标记的筛选,发现1对引物(BPCA90)在雄基因池扩增出差异条带。利用引物BPCA90检测待测样品的微卫星标记基因型,若检测得到长度约550 bp的单一片段为雄性,未检测到长度约550 bp的单一片段为雌性,从而完成对山杨的雌雄性别的鉴别。整个鉴定过程操作简单,方法鉴别率为100%,且得到条带结果清晰、鉴定过程特异性高、重复性好、稳定性强。     

利用SSR标记进行小麦品种鉴定和新品种保护研究

利用变性聚丙烯酰胺电泳结合银染技术,检测了8个SSR位点在71份中国育成小麦品种(系)中的多态性,确定了各SSR位点上等位基因的大小。在71份小麦品种(系)中,共检测到等位基因75个,每对引物检测到的等位基因个数最少为6个(gwm186),最多为15个(gwm174),平均9.4个。PIC值最高为0.8739(gwm174),最低为0.6552(gwm186),平均为0.7968。利用少数几对高PIC值的SSR引物,能够将全部71份品种(系)区分开来,供试材料间至少有一对等位基因存在差异。对SSR标记应用于小麦品种鉴定和品种保护的可行性进行了讨论。     

利用SSR标记建立杂交水稻分子指纹图谱数据库

鉴别优质种子并保护育种者的知识产权是市场经济发展的需要。长期以来,人们主要通过形态特征来鉴定区分水稻种子质量,但这种鉴定方法准确性显然较差。近年来,利用不同水稻种质在DNA水平上的差异（即DNA分子指纹图谱）进行品种鉴定已引起人们的关注。RAPD标记最早被用于鉴定杂交稻的纯度,并取得较好的结果。但由于RAPD标记不够稳定,且为显性标记难以将亲本和F1杂种区分开,因而在水稻纯度鉴定和指纹图谱分析中利用有限。由于SSR是共显性标记且多态性丰富,相比其他标记如RFLP或RAPD,更能揭示生物遗传多样性。     

基于 SSR 标记的 12 个非洲菊品种指纹图谱构建及杂交 F1 后代鉴定

【目的】基于 SSR 分子标记对 12 份非洲菊种质进行亲缘关系分析及部分种质杂交 F1 后代真假杂种鉴定,以期为非洲菊种质资源鉴评及创新利用提供技术支撑。【方法】收集 12 个非洲菊种质资源,提取其基因组 DNA 后,利用 50 对 SSR 引物进行 PCR 扩增,通过检测相关多态性结果进行聚类分析和指纹图谱构建,以及部分品种杂交 F1 后代鉴定。【结果】18 对引物在 12 份非洲菊材料中共扩增出 74 个多态性等位变异片段,平均每对引物扩增出多态性等位变异片段 4.1 个。利用 74 个等位位点,构建了 12 份非洲菊种质资源的系统进化树,UPGMA 聚类分析结果显示,当遗传系数为 0.75 时,可将受测的 12 份种质分为 5 组,Ⅰ组为‘云南红’‘大088’‘情人’,Ⅱ组为‘粉佳人’‘粉球’‘真爱’和‘福娃’,Ⅲ组为‘绣色’‘淑女’和‘黄球’, Ⅳ组和Ⅴ组均只包含 1 个品种,分别是‘紫水晶’和‘深圳 5 号’。筛选出 GHSSR-1、GHSSR-18、GHSSR-20和 GHSSR-21 等 4 对引物,可完全区分 12 份种质;其中,后 3 对引物鉴定出兼具双亲特异位点的单株分别是Gh-5、Gh-4 和 Gh-1,单独 1 对引物的鉴定率为 33%。且受检的 3 个单株均为真杂种,真杂种率为 100%。【结论】成功构建 12 份非洲菊品种的指纹图谱,综合 3 对多态性较好的引物鉴定出 3 株非洲菊杂交 F1 后代实生苗为真杂种,为非洲菊资源鉴评和创新利用提供可靠的 SSR 标记引物。     

中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记鉴定

【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道参考转录组进行de novo组装,并进行功能及代谢通路注释,进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫,将纯化的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)孢子饲喂3日龄幼虫,剖取4、5和6日龄幼虫肠道,液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染球囊菌的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads,利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx(E-value10-5)比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库,对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物,通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads,de novo组装得到43 557个unigenes,平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库,单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示,11 442条unigenes分布于25个基因家族,其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多,达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示,在生物学进程分类中,注释到细胞进程的基因最多,达4 201个,在分子功能和细胞组分类中,注释到结合与细胞的基因数最多,分别为4 935和2 900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路,注释到核糖体的基因数最多,达385个。利用MISA软件,可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点,随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增,有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组,可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息,也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组,基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记,可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究,也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。     

椰子SSR分子标记筛选

[目的]筛选可用的SSR分子标记,加快椰子分子辅助育种进程。[方法]采用改良CTAB法提取椰子基因组DNA,以基因组DNA为模板,对36对SSR引物进行筛选,以条带清晰、多态性丰富为引物筛选原则。[结果]共筛选出7对具有多态性的引物,其中2对多态性较丰富,可用于后续SSR分子标记分析。[结论]该研究为开展椰子种质资源遗传多样性系统分析提供了SSR引物。     

基于荧光检测技术的小麦品种SSR鉴定体系的建立

【目的】建立基于SSR荧光标记的小麦品种DNA指纹鉴定体系,为中国小麦育成品种鉴定提供高通量技术手段。【方法】收集已定位到小麦21条染色体上的SSR标记引物,通过PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术,筛选在中国小麦育成品种中多态性高的标记,对筛选出的引物5′末端利用6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4种荧光染料之一进行标记,利用DNA分析仪对扩增产物的峰型进行评价并检测不同等位变异的扩增片段大小,选择峰型简单易读、多态性高、较均匀分布到21条染色体上的标记,确定不同位点等位变异的大小及相应的参照品种,建立基于荧光SSR标记的高通量小麦品种鉴定体系。【结果】利用2 438对SSR标记对8份植物学性状差异大的小麦育成品种进行初步筛选,共筛选出260对多态性较高、扩增稳定的SSR引物。利用上述260对引物对48份小麦品种继续进行复筛,选出130对扩增稳定、多态性高、带型好的SSR引物。对这些引物的正向5′末端分别标记6-FAM、HEX、ROX和TAMRA荧光后,利用DNA分析仪进行检测评价,最终选择了42个PCR扩增稳定、峰图简单、多态性高、连锁群分布均匀的SSR荧光标记。根据DNA分析仪检测到的每个标记的不同等位变异大小,为相应位点的不同等位变异进行了命名,并为每个等位变异选取了相应参照品种。根据每个引物标记的荧光和扩增的片段大小范围对42对引物进行合理搭配,在同一毛细管内对多个荧光标记进行检测,提高了DNA指纹数据采集效率,降低了检测成本。利用该体系对1 625份小麦育成品种进行DNA指纹数据采集,在42个位点中共检测到434个等位变异,每个位点的等位变异个数在3-23,平均10.3个;每个位点的PIC值范围为0.240-0.829,平均0.610。利用1 625份小麦育成品种DNA指纹数据,构建了中国小麦育成品种的DNA指纹数据库。【结论】筛选出42对SSR标记引物,建立了基于荧光SSR标记的小麦品种鉴定体系,可用于高通量小麦品种DNA指纹鉴定。     

中国棉花主栽品种DNA指纹图谱构建及SSR标记遗传多样性分析

[目的]采用SSR标记构建2008年中国3大棉区8个棉花主产省份32份棉花主栽品种的DNA指纹图谱并进行遗传多样性分析.[方法]从214对候选引物中筛选出36对多态性高、稳定性好且在染色体上分布均匀的引物作为核心引物,构建棉花主栽品种DNA指纹图谱.[结果]36对SSR引物在32份材料中共扩增出142种多态性基因型,每...