棉铃虫信息素结合蛋白2 cDNA的克隆、表达与组织特异性表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR 技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2 基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT- PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21（DE3）系统中进行原核表达,使用GSTrap FF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2（GenBank登录号：EU647241）的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457 bp,编码149 个氨基酸残基,前端是一段25个氨基酸长的信号肽,推测蛋白具有昆虫信息素结合蛋白典型的6 个保守的半胱氨酸残基的特征。棉铃虫HarmPBP2在雌雄成虫的触角、足和翅中都有表达,另外在雌虫下颚须也有表达。雌雄组织表达量顺序相同,触角中表达量最高,翅中次之,足中最少。雌虫组织中表达量高于雄虫。构建的原核表达载体pGEX/ HarmPBP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为40 kD的融合蛋白,经亲和层析纯化与酶切得到去标签的HarmPBP2蛋白。【结论】克隆、分析和表达了棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA序列,并对其进行纯化,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础,同时对其表达谱进行了研究。     

雪莲PEBP基因原核表达载体的构建及表达

根据雪莲PEBP基因序列设计特异性引物,利用实验室构建的Teasy-PEBP质粒为模板,扩增PEBP基因,与表达载体pET-30a(+)连接转化BL21(DE3), PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,测序分析.经IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果表明:PEBP得到大量表达,表达量占菌体总蛋白的26.8;,融合蛋白的相对分子量大约是28KD,与理论值相符,为进一步研究该蛋白的理化性质奠定了基础.     

棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】克隆得到棉蚜(Aphis gossypii)P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础。【方法】利用RT-PCR及3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析。构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过Western blot及免疫组化检测该抗体特异性。【结果】棉蚜CYP6CY3 ORF长1 266 bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 k D,理论等电点为8.99,不含有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG××T、E××R、P××F×PE/DRT和F××G×××C×G 5个P450家族的特征基序。通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)(XP_001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81%,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)(XP_015379193.1)一致性为79%,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76%,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E××R完全保守序列及P450基因标志性的F××G×××C×G(358—367)血红素结合位点的共有序列。使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近。通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 k D,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1﹕409 600。Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异性结合,具有较好的免疫反应特异性。【结论】利用3′-RACE技术克隆获得CYP6CY3的开放阅读框,并用异源表达的蛋白免疫昆明白小鼠制备了高滴度、特异性强的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗体,可用于进一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗药性方面的作用。     

梨磷脂酰胆碱转移蛋白基因的克隆及其表达分析

据转录组测序结果,结合RACE(cDNA末端快速扩增技术)和Genome walking(染色体步移技术)获得了梨磷脂酰胆碱转移蛋白基因的完整读码框序列,其开放阅读框长为1 323 bp,编码的440个氨基酸序列与葡萄磷脂酰胆碱转移蛋白质的同源相似性达73%,其具有START domain(启动域)、ZnF_TAZ(TAZ锌指结构)、DCD(双氰胺)保守结构域,将梨磷脂酰胆碱转移蛋白基因命名为PePCTP1。PePCTP1基因与GFP融合,构建植物表达载体,洋葱表皮亚细胞定位观察结果显示,PePCTP1基因编码的蛋白质分布在细胞膜上。用激素生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(6-BA)及NaCl诱导处理,发现与对照(CK)相比,SA和GA处理后PePCTP1基因表达量显著上升;NaCl和IAA处理后PePCTP1基因的表达量随时间逐渐上升;而ABA和6-BA处理不能增加目的基因的表达量。据此推测PePCTP1可能参与梨的逆境胁迫抗性反应。     

雪莲类PEBP基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了构建雪莲类PEBP基因真核表达载体,在毕赤酵母中表达并鉴定.将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到真核表达载体pPIC9k上,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内,利用筛选到的Muts(methanol utilization slow)重组酵母株进行表达,经SDS-PAGE分析,表达产物置于低温条件下进行抗冻试验.结果在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为20 kD,与预期相符,上清液抗冻检测表明PEBP具有一定的抗冻性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达.该研究成功构建了真核表达载体pPIC9k-PEBP,获得了表达产物,并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础.     

瓜实蝇普通气味结合蛋白基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae (Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP.测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨...     

棉铃虫Gq蛋白α亚基基因的克隆及组织特异性表达

 【目的】了解棉铃虫体内Gqα的组织特异性表达情况。【方法】利用RACE技术获得了Gqα全长基因，利用半定量RT-PCR研究了该基因的时空表达情况。【结果】从棉铃虫Helicoverpa armigera触角中克隆了一条全长1 101bp的Gqα cDNA序列，命名为GqαHarm；阅读框全长1 062 bp，编码353个氨基酸残基。GqαHarm与已报道的昆虫Gq蛋白α亚基同源性在90％以上，与近缘种甘蓝夜蛾Mamestra brassicae Gqα的同源性高达96.88％，与家蚕Bombyx mori Gqα的同源性高达97.73％。半定量RT-PCR研究表明，GqαHarm在棉铃虫雌雄成虫触角中表达，在头、胸、腹、足和翅中也有表达，并且表达量差异不显著；此外，在喙、下颚须和下唇须中也有表达；在卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达；在卵中的表达量最高，而在成虫中的表达量最低，在幼虫和蛹的前、中、后期的表达量差异不大。【结论】研究表明GqαHarm是一种在棉铃虫体内普遍存在的蛋白。     

番茄SYTA的克隆及表达分析

【目的】克隆获得番茄SYTA(Solanum lycopersicum STYA,S.l SYTA),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确S.l SYTA亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确S.l SYTA在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的SYTA同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆S.l SYTA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对S.l SYTA蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位S.l SYTA的表达量以及在TMV胁迫的番茄中S.l SYTA的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-SYTA-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的S.l SYTA基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有SYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示S.l SYTA定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中S.l SYTA的表达量从高到低依次为根叶茎;TMV-GFP侵染番茄导致其S.l SYTA表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在S.l SYTA瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的S.l SYTA具有SYTs家族的典型特征。S.l SYTA定位于细胞质膜,S.l SYTA在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下,番茄中S.l SYTA表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达S.l SYTA有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。     

中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA的克隆及原核表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a（+）/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2（GenBank登录号：DQ449667）的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429 bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7 kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Acer-ASP2极有可能属于GOBP家族。构建的原核表达载体pET/Acer-ASP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为21kD的融合蛋白,融合蛋白大部分以包涵体的形式存在于菌体沉淀中（约59.7%）,经洗涤和尿素梯度溶解对包涵体进行了纯化,经凝胶光密度扫描分析,约占最终产物的81.2％左右。【结论】克隆、分析和表达了一个新的编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2 cDNA序列,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础。     

青稞类钙调素蛋白基因CML19的克隆、序列分析及原核表达

根据鉴定得到青稞类钙调素蛋白基因CML19的序列设计引物,以青稞叶片的cDNA为模板,扩增得到目的片段,对目的基因序列进行鉴定和分析,进一步构建该基因的原核表达载体pET28a-CML19,转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明,扩增得到CML19的CDS序列全长为447bp,编码的蛋白质含有148个氨基酸,分子质量为16.46ku,理论等电点(pI)为4.40,总平均亲水性(GRAVY)为-0.176,不稳定系数为49.59,存在典型的EF手结构域;系统进化分析表明,青稞CML19与山羊草具有较近的亲缘关系;原核表达蛋白结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。初步阐明青稞CML19基因的序列特征,为进一步制备抗体、探讨CML19基因的功能奠定基础。     

异色瓢虫胁迫对棉铃虫生长发育及压力蛋白基因表达的影响

【目的】明确不同食源异色瓢虫(Harmonia axyridis)胁迫对棉铃虫(Helicoverpa armigera)生长发育和变态发育的影响,探讨棉铃虫是否能感知并分级捕食风险、能否在生长发育和变态发育上体现出权衡效应;明确长时和短时胁迫对棉铃虫压力蛋白基因表达的影响,探讨异色瓢虫胁迫能否引起棉铃虫分子水平上的生理反应。【方法】通过设置7种不同食源的异色瓢虫胁迫处理(饥饿处理、虾卵处理、棉铃虫幼虫处理、棉铃虫卵处理、蚜虫处理、蚜虫对照处理、对照处理),观察记录棉铃虫在胁迫下的生长发育(幼虫历期、蛹历期、雌雄蛾寿命、总寿命)和变态发育(蛹重、化蛹率、羽化失败率、卷翅率)指标;设置长时(1龄幼虫至3日龄成虫)和短时(15 min至6 h)异色瓢虫胁迫处理,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测棉铃虫压力蛋白基因(即热激蛋白基因)Hsp70和Hsp90及热激同源蛋白基因Hsc70在胁迫后的表达水平变化。【结果】在捕食性天敌异色瓢虫的胁迫下,棉铃虫幼虫历期、蛹期、雌雄蛾寿命、总寿命均显著性缩短,蛹重和化蛹率显著性下降,成虫卷翅率显著性升高,而羽化失败率无显著性变化。在不同食源的天敌胁迫下,棉铃虫幼虫历期在异色瓢虫取食蚜虫时最短,蛹历期在瓢虫取食棉铃虫卵时最短,总寿命在瓢虫取食虾卵时最短,而雌雄蛾寿命在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异;棉铃虫成虫卷翅率在瓢虫取食棉铃虫卵时最高,而蛹重、化蛹率、羽化失败率在不同食源天敌胁迫下未表现出显著性差异。压力蛋白基因Hsp70和Hsp90在短时胁迫下(Hsp70:30min至3 h;Hsp90:15 min、1.5 h、2 h、6 h)表达水平显著性上调,热激同源蛋白基因Hsc70在长时胁迫下(5龄幼虫、预蛹、雄蛹、雌蛾阶段)表达水平显著性上调。【结论】在面对捕食性天敌异色瓢虫长时胁迫作用下,棉铃虫各生长发育阶段均出现缩短的现象,即棉铃虫为躲避被捕食风险表现出了发育加速的现象,而快速的生长发育在一定程度上干扰了变态发育,导致蛹重和化蛹率下降,成虫卷翅率提高,符合权衡效应。棉铃虫对不同食源的天敌胁迫具有不同程度的敏感性,即棉铃虫对潜在的捕食风险可能存在一定的分级能力,但这种分级能力没有得到规律性体现。异色瓢虫胁迫能够引起棉铃虫分子层面的生理反应,导致压力蛋白基因的表达上调,其中压力蛋白基因Hsp70和Hsp90受到短时胁迫的反应较为明显,而热激同源蛋白基因Hsc70受到慢性胁迫刺激的反应更为显著。     

茶尺蠖信息素结合蛋白PBP2的基因克隆、原核表达及其结合功能

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)进行全长cDNA序列克隆(Gen Bank登录号为KX421383)后,将该基因与pET32a载体连接构建表达载体。随后向导入pET32a/EoblPBP2表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中对其表达载体加入终浓度1 mmol·L~(-1)的IPTG进行蛋白的诱导表达,进一步利用镍NTA琼脂糖凝胶柱和含有咪唑的上清缓冲液分离目的蛋白,以PBS缓冲液作为透析液纯化得到高浓度重组蛋白。最后通过荧光竞争法,利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子以放大荧光信号,随后向重组蛋白与1-NPN混合体系中分别加入(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯以及10种测试气味后经过分子荧光光度计扫描得到相对荧光值,计算各配基的解离常数KD,研究重组蛋白与茶尺蠖性信息素和茶树挥发物的生理功能。【结果】EoblPBP2全长为492 bp,编码了163个氨基酸,蛋白相对分子质量为15.9kD,等电点为4.983,具有保守的6个半胱氨酸,根据分子进化树分析其应归属于昆虫PBPs家族。结合功能结果显示,10种测试气味均能将1-NPN与茶尺蠖EoblPBP2重组蛋白的混合体系于420 nm处的相对荧光值降至50%以下。其中β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5种茶树挥发物质与EoblPBP2重组蛋白的结合能力较强,解离常数KD分别为7.923、14.830、30.368、28.068和27.597μmol·L~(-1)。而性信息素成分之一的(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯与EoblPBP2的解离常数KD仅为172.591μmol·L~(-1),仅小于苯甲醇的解离常数KD 230.880μmol·L~(-1),而远远大于上述5种气味物质。表明EoblPBP2重组蛋白具有茶尺蠖性信息素成分((Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯)和植物挥发物质广谱结合能力,而其与性信息素的亲和力弱于大部分测试植物挥发物。【结论】EoblPBP2能与包括性信息素成分在内的多种植物挥发物结合,可能是一种具备特殊复合功能的信息素结合蛋白,可用之进一步研究茶尺蠖的性信息素识别和传递途径。     

棉铃虫复眼中Clock生物钟基因的昼夜表达模式

【目的】克隆并分析棉铃虫(Helicoverpa armigera)复眼Clock(Clk)生物钟基因的c DNA序列,探讨棉铃虫复眼中Clk生物钟基因的昼夜表达模式及其表达水平的影响因子,以确认其在复眼中是否起着调节生物节律的功能,为理解复眼中生物钟基因网络提供理论参考。【方法】以2日龄棉铃虫复眼为试验材料,采用RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆棉铃虫Clk生物钟基因。利用生物信息学软件对得到的棉铃虫CLK氨基酸序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,检测棉铃虫成虫不同器官(头、胸、腹、足、翅、脑、触角、复眼)中Clk生物钟基因的表达水平;通过设置不同的光周期环境,检测复眼中Clk生物钟基因的昼夜表达模式;通过在暗期设置6 h不同波段光(UV、蓝光和绿光)照射,检测复眼中Clk生物钟基因的表达水平;通过设置棉铃虫雌雄蛾交配处理,检测交配结束0 h和3 h复眼中Clk生物钟基因的表达水平;通过饥饿处理棉铃虫雌雄蛾,检测复眼中Clk生物钟基因的表达水平。【结果】克隆得到棉铃虫Clk生物钟基因的c DNA序列,命名为He CLK(Gen Bank登录号为KM233158),开放读码框1 860 bp,编码619个氨基酸组成的多肽,理论推测分子量(Mw)为69.32 k D,等电点(p I)为5.71。推导得到的氨基酸序列具有3个跨膜拓扑结构,包含多个昆虫CLK蛋白的保守区域(PAS和HLH),其与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)的同源性较高,分别为97%和74%。与点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)和马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)的同源性较低,分别为53%和52%。q RT-PCR结果表明在检测的成虫器官中,He CLK在复眼中表达水平最低,触角中表达水平最高。在14L﹕10D光周期下,复眼中He CLK的表达量在白天增高,夜晚下降。生物钟基因的昼夜表达模式在1 d黑暗下可以持续,而在持续黑暗下固有表达节律消失。复眼中He CLK的表达水平在6 h光照后上调,但不同波段光照射无显著性差异。复眼中He CLK的表达水平在交配后有下调趋势,在雄蛾交配后表达水平显著性下降。复眼中He CLK的表达水平在饥饿处理后无显著性变化。【结论】成功从夜蛾棉铃虫的复眼中克隆得到Clk生物钟基因,由Clk生物钟基因推导得到的氨基酸序列具有典型的CLK蛋白特征,且与昆虫CLK蛋白同源性较高。在检测的棉铃虫成虫器官中,He CLK在复眼中的表达水平最低。He CLK在外周组织复眼中的表达水平受蛾类自身节律、光照和蛾类生理状态的影响,证实棉铃虫复眼中He CLK在调节生物节律方面具有重要作用,但生物钟基因网络在复眼与中枢神经中是否类似有待进一步深入研究。     

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）并对其序列特征及分布情况进行研究,为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并用MEGA6.0的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,应用服务器Chou & Fasman预测蛋白的二级结构,通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因,命名为FoccOBP1（GenBank登录号：KM527948）;该基因cDNA序列全长660 bp,其中开放阅读框450 bp,编码149个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,具有真核生物polyA加尾结构,5′末端非编码区长38 bp,预测成熟蛋白分子量为16.39 kD,等电点为7.46,N端有22个氨基酸组成的信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征,其排列方式为C1-X₂₆-C2-X₃-C3-X₄₀-C4-X₉-C5-X₈-C6,符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域,第74-83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显,可能是脂溶性气味分子的结合位点;FoccOBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支,其中与绿盲蝽（Apolygus lucorum）的AlucOBP8（GenBank登录号为AFJ54049.1）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）的AlinOBP5（GenBank登录号为ACZ58031.1）、牧草盲蝽（Lygus lineolaris）的LlinOBP2（GenBank登录号为AHF71029.1）同源相似性最高,其次是棉蚜（Aphis gossypii）的AgosOBP7（GenBank登录号为AGE97637.1）、大豆蚜（Aphis glycines）的AglyOBP7（GenBank登录号为AHJ80893.1）、禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）的RpadOBP7（GenBank登录号为AHL30243.1）等昆虫的OBP,表明FoccOBP1与这些基因的亲缘关系也较近;经FoccOBP1蛋白的二级结构预测,FoccOBP1以α-螺旋为主,其次是β-折叠,转角含量较少;经不同发育阶段检测发现,FoccOBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高,且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低,在雌雄成虫间的表达量也有差异;在初羽化成虫的不同组织检测发现,FoccOBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达;构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1。【结论】明确了FoccOBP1的核苷酸、氨基酸序列特征,分析了该蛋白的二级结构特征,根据FoccOBP1在西花蓟马中的时空表达情况,推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色;成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1,为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下基础。     

胡椒碱和山椒醇经历对棉铃虫幼虫取食的影响

【目的】拒食剂是通过改变农作物对害虫的适口性来调控其取食行为的一大类化学物质。使用拒食剂对害虫取食行为进行生态调控,可有效地克服化学防治带来的负面影响。但害虫随着取食经历会对拒食剂表现出很强的味觉适应能力,尤其是味觉习惯化限制了这类物质的大田应用。论文旨在明确两种酰胺类拒食剂胡椒碱和山椒醇作用于多食性棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫的感觉器官类型,以及两种拒食剂取食经历对棉铃虫后期取食行为的影响,为此类拒食剂在农田大规模应用提供依据。【方法】首先在两项选择式条件下,测试棉铃虫幼虫对胡椒碱和山椒醇的嗅觉趋向性反应,并在非选择性条件下测定棉铃虫幼虫在首次接触山椒醇和胡椒碱处理过的烟草叶碟后的取食持续时间,然后以4龄幼虫的拒食中浓度为基础,研究棉铃虫幼虫前期对含有胡椒碱、山椒醇或二者混合物的饲料的取食经历对后期取食选择反应的影响。【结果】选择性趋性反应测试结果表明,胡椒碱和山椒醇释放到环境中的气味对棉铃虫并没有显著的嗅觉驱避作用。棉铃虫幼虫首次接触处理烟草叶碟后的取食持续时间为30 s左右,比对照叶碟上的取食持续时间（100 s以上）显著缩短,该反应时间和模式昆虫烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫典型的味觉摄入后反应的时间相吻合。胡椒碱和山椒醇对4龄棉铃虫幼虫的拒食中浓度分别为0.2259和0.4003 mg/叶碟（1.5 cm ID）。取食经历效应测试发现,有过胡椒碱和山椒醇取食经历的试虫仍然受到相应经历物质的极显著拒食作用,说明两种物质以4龄幼虫拒食中浓度混入人工饲料,从3龄幼虫开始进行取食经历诱导,发育至5龄幼虫期时并没有对所经历的物质产生明显的习惯化现象。有山椒醇经历的试虫极显著受胡椒碱的拒食作用,但有胡椒碱取食经历的试虫则会对山椒醇产生味觉习惯化反应,说明二者存在不对称的交叉习惯化现象。无论是组内处理叶碟和对照叶碟被食量差异的角度分析,还是相同测试环境下不同经历组别拒食反应率的角度进行分析,均未发现胡椒碱和山椒醇组成的二元混合物对味觉习惯化的明显延缓作用。【结论】胡椒碱和山椒醇通过味觉摄入后效应对棉铃虫幼虫起到拒食作用,均不易使棉铃虫幼虫产生习惯化,且混用也不会显著延缓习惯化的过程。这两种酰胺类拒食剂有望在农田应用中兼治更多的靶标害虫。     

虱螨脲亚致死剂量对棉铃虫生长发育和繁殖力的影响

用虱螨脲亚致死剂量处理棉铃虫1龄幼虫和3龄幼虫,结果表明:虱螨脲具有较强后效性,能降低棉铃虫化蛹率、羽化率、产卵量,提高畸形蛹、畸形蛾比例.1龄幼虫按0.1和0.2 mg/kg一次饲毒后,化蛹率分别为20.00%和15.50%,与对照相比显著降低;处理代雌、雄成虫羽化率分别下降6.50%、9.91%和18.48%、21.76%,雌、雄畸形蛾率分别上升15.61%、12.71%和27.55%、19.50%,产卵量下降34.06%和36.50%.第2、3代与第1代相比,化蛹率、羽化率、产卵量、卵孵化率逐渐有所提高,畸形蛹率、畸形蛾率降低,但与对照仍存在差异,表明虱螨脲对试虫的影响随世代延续而减弱,但至少可持续到第3代,且随用药剂量提高,其影响加大.与1龄幼虫饲毒结果相比,对3龄幼虫的影响程度相对较小,但趋势一致.     

中华蜜蜂CREB基因的克隆及表达

【目的】克隆中华蜜蜂（Apis cerana cerana）的cAMP反应原件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB)基因全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,并解析中华蜜蜂CREB在大脑中的表达特征,为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,解剖其大脑获得脑组织,提取大脑组织的总RNA。在此基础上,利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂大脑的CREB基因(AcCREB),然后用DNAstar软件中的Seqman程序将CREB正反向测序后的序列拼接获得CREB基因的cDNA序列,其氨基酸序列通过Bioedit软件按照六框翻译而成;用BLASTn和BLASTp进行序列比对分析;用ClustalX进行多重序列比对和同源性比较;用MEGA软件的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,明确其系统进化关系。并通过SMART数据库分析AcCREB的结构域。另外,将解剖好的蜜蜂大脑制成石蜡切片,并采用地高辛原位杂交技术分析AcCREB在中华蜜蜂大脑中的分布表达情况。【结果】中华蜜蜂CREB基因的cDNA全序列全长890 bp,编码240个氨基酸残基,序列提交到GenBank（登录号为KC814690）。其编码的蛋白预测分子质量为25.691 kD,等电点为5.82。结构域分析结果显示,该蛋白具有AA 89-131的PKID和AA 176-237的BRLA两个保守结构域。氨基酸序列比对结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂、印度跳蚁、家蚕、埃及伊蚊、疟原虫、人类、小鼠10个物种的同源蛋白相似度分别为98.76%、98.35%、97.11%、94.09%、72.22%、58.97%、44.69%、41.69%、36.89%、36.89%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与西方蜜蜂的CREB亲缘关系最近,与熊蜂、大黄蜂之间的亲缘关系次之。另外,经过地高辛原位杂交技术处理后,在中蜂大脑蘑菇体的凯尼恩细胞、触角叶周围的细胞和大脑的髓质与小叶之间的细胞均有阳性着色,而且AcCREB在中华蜜蜂工蜂左右大脑的阳性着色不对称。【结论】AcCREB的氨基酸序列与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂高度同源,且基因在大脑中的分布暗示其可能参与了中华蜜蜂学习记忆过程。     

沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表达及其结合特性

【目的】 沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】 GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L ^-1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L ^-1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L ^-1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。     

编码棉铃虫化学感受蛋白cDNA的克隆及序列分析

 从棉铃虫触角中克隆了一条全长722bp的cDNA序列，命名为CSPHarm。CSPHarm阅读框全长381bp，编码127个氨基酸残基，推导的氨基酸序列具有昆虫化学感受蛋白的典型特征。CSPHarm与已报道的其它昆虫的化学感受蛋白的氨基酸序列有很高的同源性，因此，CSPHarm是一个编码棉铃虫化学感受蛋白的基因。CSPHarm具有强烈的亲水性，但是在第20～30位的氨基酸组成一个亲脂性的结构，这可能是结合亲脂性气味物质的区域。半定量RT-PCR研究结果显示，CSPHarm在棉铃虫头、胸、腹、足、翅和触角等组织中表达量都很高，在不同组织中的表达量没有明显的区别，在卵、幼虫、蛹和成虫体内也都有表达，在卵中表达量相对较低，在成虫体内表达量较高。