昆虫酚氧化酶作用机制的研究进展

酚氧化酶（Phenoloxidse,PO）是昆虫体内一类重要的氧化酶,在昆虫的正常生长发育过程中具有重要的生理功能。阐述酚氧化酶在昆虫免疫防御及其他生理发育过程中的作用机制,以及可能影响昆虫发育和免疫的诸多因子与酚氧化酶间的关系,以期为进一步探究酚氧化酶对昆虫自身调控机制提供新的思路。     

虫酰肼对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用

【目的】研究证实虫酰肼是否对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)酚氧化酶活性具有抑制作用。【方法】采用生物化学方法,分别测定虫酰肼对甜菜夜蛾5龄幼虫离体酚氧化酶的作用特点和用虫酰肼浸泡饲料饲喂5龄幼虫后,虫酰肼对幼虫头部、血淋巴及表皮组织酚氧化酶活性的抑制作用。【结果】随着虫酰肼浓度增大,酚氧化酶活力呈逐渐下降趋势,虫酰肼对酚氧化酶的抑制中浓度(IC50)为5.43μmol·L-1。虫酰肼对酚氧化酶的抑制作用表现为混合型抑制,游离酶抑制常数(K i)和酶-底物络合物抑制常数(K is)分别为11.223μmol·L-1和34.036μmol·L-1。通过研究金属铜离子和酶液对虫酰肼吸收峰的影响,推测虫酰肼对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用不是与该酶活性中心的铜离子结合,而可能是与酚氧化酶蛋白结合发生作用有关。用28.41μmol·L-1和85.23μmol·L-1亚致死剂量浓度的虫酰肼分别处理甜菜夜蛾5龄幼虫24、48和72h后,测定其头部、血淋巴和表皮酚氧化酶的活性。结果表明,随着用虫酰肼处理时间延长,两个剂量的虫酰肼对幼虫头部、血淋巴和表皮酚氧化酶的抑制作用基本呈逐渐增大趋势;处理后相同时间,高剂量的虫酰肼对酚氧化酶活性的抑制率基本上高于低剂量的抑制率;虫酰肼对头部酚氧化酶的抑制率最高,血淋巴次之,表皮最低。【结论】虫酰肼对甜菜夜蛾酚氧化酶具有明显的抑制作用,幼虫新表皮形成过程受到阻碍可能与虫酰肼抑制酚氧化酶的活性有关。     

克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA组织分布特性研究

酚氧化酶原系统是甲壳动物体内与免疫相关的重要功能系统之一,对于甲壳动物的防御反应具有重要作用。本研究针对克氏原螯虾酚氧化酶原基因保守序列设计引物,利用实时荧光定量PCR法对克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA的组织分布进行了初步研究。结果表明,克氏原螯虾酚氧化酶原基因在血淋巴、肝胰腺、卵巢和精巢中转录水平较高;在肌肉、表皮和鳃中有较弱表达;而在肠和胃中几乎无表达。此种组织表达特性可能与酚氧化酶原基因在机体生命活动过程中的功能有关。     

酚氧化酶活力测定方法中关于测定时间的研究

以克氏原螯虾(Procambarus clarkii)血清酚氧化酶为材料,采用Ashida的分光光度法测定了不同活力酚氧化酶与L-DOPA在60 min内每2 min生成物的吸光度以及计算了不同时间的酚氧化酶活力.结果显示,当测定时间为60 min时,随着酚氧化酶活力升高,吸光度与测定时间的直线相关系数逐渐降低,反映了测定的酚氧化酶活力准确性也越差,与其他已报道的南美白对虾(Penaeus vannamei)、中国对虾(Penaeus chinesis)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)等虾蟹类及昆虫(Pieris rapae)的酚氧化酶活力测定结果相似.与6 min时的相关系数和酶活力计算结果相比,当测定时间长于12 min时相关系数显著变小(P﹤0.05),而短于6 min时也有变小的趋势;当测定时间长于10 min时酚氧化酶活力计算结果显著变小(P﹤0.05).通过不同测定时长的相关系数以及酚氧化酶活力计算结果的差异性比较,得出酚氧化酶活力测定最为准确的测定时长(t)为6 min≤t＜10 min,最佳时长为6 min.     

硫脲对槐尺蠖酚氧化酶活性的抑制作用

以邻苯二酚为底物,采用分光光度计法测定了硫脲对已纯化的槐尺蠖酚氧化酶的影响.结果显示,在硫脲浓度为0～0.5 μmol/L时,可以抑制酚氧化酶的活力,且随着硫脲浓度的增大,酚氧化酶的活性降低;当硫脲浓度达到0.4 μmol/L时,酚氧化酶剩余活力还不到20%.采用连续测活的方法测定了不同硫脲浓度下,酚氧化酶催化氧化邻苯二酚的酶促反应动力学.结果表明,反应时间足够长时,酶促反应速率不再改变,达到最大反应速率;但最大反应速率随着硫脲浓度的增大而降低.双倒数作图法显示,硫脲对酚氧化酶的抑制作用属于非竞争性抑制.     

中华管鞭虾多酚氧化酶生化特性研究

对中华管鞭虾中多酚氧化酶（PPO）的活性及其影响因素进行研究,讨论了最适反应温度、pH、特异性底物及其酶动力学性质,激活剂对酚氧化酶的激活作用,抑制剂对酚氧化酶的抑制作用。结果表明：中华管鞭虾酚氧化酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0;十二烷基硫酸钠（SDS）对PPO的激活作用最大,其次为胰凝乳酶和β-葡聚糖,激活率分别为71.9%、62.4%和33.4%;4-己基间苯二酚对PPO抑制作用最强。     

家蚕眠期血淋巴酚氧化酶活性变化及其基因表达分析

[目的]探究酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)及酚氧化酶在家蚕眠期血淋巴中的变化规律,为深入解析家蚕眠期酚氧化酶的功能及其基因表达特征提供新线索.[方法]以家蚕四龄将眠、四龄眠(头壳刚开裂)0h、四龄眠6 h、四龄眠12 h、四龄眠24 h和五龄起蚕为试验材料,采用实时荧光定量PCR检测其血淋巴PPO1和PPO2基因的表达情况,并分析血淋巴酚氧化酶活性的变化规律.[结果]家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因在四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期均有一定程度的表达,且两者的变化规律一致,表现为四龄将眠最高、五龄起蚕最低,总体上呈先减后增再减的变化趋势.在家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性整体上也呈先降低后急剧升高再降低的变化趋势,四龄将眠为5.99 U/mg,五龄起蚕为6.02 U/mg,与酚氧化酶原基因表达模式基本一致.[结论]家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性变化规律与酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的转录表达模式基本一致,说明酚氧化酶在家蚕眠期即发挥免疫防御功能,又参与蚕体新旧表皮的更替过程.     

曲酸对小菜蛾酚氧化酶抑制作用的研究

 研究了曲酸对小菜蛾酚氧化酶的单酚酶和二酚酶活力的影响并初步探讨了其抑制作用机理，结果表明,曲酸对小菜蛾酚氧化酶的单酚酶和二酚酶活力均有抑制作用，其I50分别为0.07 mmol·L-1和1 mmol·L-1。曲酸对单酚酶活力表达的迟滞时间有明显的延长效应，对二酚酶的抑制作用表现为典型的可逆竞争型抑制类型，其抑制常数Ki为0.47 mmol·L-1。曲酸与酚氧化酶中催化氧化反应活性中心的Cu2+鳌合可能是其产生抑制作用的重要原因。金属铁离子可明显地缩短单酚酶的迟滞时间，但对单酚酶的活力无明显影响。     

大豆连作土壤多酚氧化酶研究

土壤多酚氧化酶与土壤有机质的形成有关，是腐殖化的一种媒介。但由于耕作栽培措施不同，对土壤温度、温度都会产生一定影响。进而影响了土壤多酚氧化酶的活性，而多酚氧化酶活性的强弱又影响了土壤酚的含量，土壤酚含量又影响了植株干物质积累。表明土壤酚直接影响植株的正常生长发育，使株株干物质积累降低，这可能是造成大豆减产的原因之一。     

昆虫激素对家蚕血淋巴和体壁酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响

[目的]研究外源昆虫激素对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响,明确昆虫激素对酚氧化酶的调控作用,为深入解析家蚕酚氧化酶的功能及基因表达调控机制提供参考依据.[方法]对五龄第3d发育良好的家蚕幼虫注射蜕皮激素20E和保幼激素JH,以注射等量0.1%二甲基亚砜(DMSO)为对照,分别在注射3、6、12和24 h后解剖家蚕幼虫采集血淋巴和体壁,检测分析家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的变化情况.[结果]注射外源JH和20E均能促进家蚕血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达,有效增加酚氧化酶活性.家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因对JH和20E的响应时间存在一定差异,其中,经JH处理后2个酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)仅在处理6和12 h时显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调表达;而经20E处理后PPO1和PPO2基因从3 h开始一直持续到12 h均呈上调表达趋势.JH和20E对家蚕体壁PPO1和PPO2基因的影响恰好相反,具体表现为:JH能有效抑制家蚕体壁PPO1和PPO2基因的表达,降低酚氧化酶活性;20E则促进家蚕体壁PPO1基因上调表达,但不影响PPO2基因表达.[结论]家蚕酚氧化酶原基因PPO1和PPO2表达受JH和20E的调控,且激素对酚氧化酶原基因表达水平的影响与其酶活性变化规律一致,提示酚氧化酶不仅参与昆虫激素的代谢,还与激素协同调控家蚕的蜕皮变态.     

不同提取方法对东亚飞蝗酚氧化酶活性的测定与比较

[目的]研究东亚飞蝗酚氧化酶活性及动态变化。[方法]通过不同抽提方法制备虫体体液和淋巴液,测定不同位点酚氧化酶活性及动态变化。[结果]血淋巴中酚氧化酶活性显著高于虫体体液中酚氧化酶活性,且雌虫酶活性显著高于雄虫;虫体体液内酚氧化酶活性随着体外放置时间的延长而显著增强;成虫血淋巴内酚氧化酶活性随着时间的延长而显著增强。[结论]酚氧化酶一部分存在于东亚飞蝗组织和细胞中参与虫体发育和构建,一部分存在于血淋巴中参与免疫防御作用。酚氧化酶稳定性非常强,是昆虫宽泛适应能力和强大免疫能力的有效保障。     

锯缘青蟹血蓝蛋白酚氧化酶活性研究

以锯缘青蟹Scylla serrata为研究对象,运用亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基璜酸钠(SDS)-PAGE、Western-blot以及酚氧化酶活性测定等方法研究了锯缘青蟹血蓝蛋白的酚氧化酶活性以及几种金属离子对其酚氧化酶活性的影响.研究结果表明,锯缘青蟹血蓝蛋白在没有任何诱导物作用的情况下表现出酚氧化酶活性,胰蛋白酶对此活性有轻微抑制作用;与对照组相比,Ca2 和Cu2 能使血蓝蛋白酚氧化酶活性显著增强,增强率分别为281%和273%;EDTA可显著抑制Cu2 对血蓝蛋白酚氧化酶活性的激活作用,抑制率达78.5%.由此可知,锯缘青蟹血蓝蛋白确有酚氧化酶活性,且受Ca2 、Cu2 等金属离子作用的影响.     

核型多角体病毒对棉铃虫酯酶和酚氧化酶活性的影响

对感染核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)的棉铃虫Helicover pa armigera (Huebner)幼虫血淋巴进行了酯酶和酚氧化酶电泳分析。结果表明：2种酶带在感染12h后其活力发生了明显变化；酯酶酶带2d后发生位移，酚氧化酶酶带5d发生位移，且各自建立新的酶系统。酚氧化酶比活力分析结果表明：感染NPV后，1d达到最高点，2～3d处于最低点，4d后回升。     

秦岭南坡锐齿栎林、松栎混交林几种土壤酶活性的初步研究

对秦岭南坡锐齿栎林、松栎混交林土壤中的脲酶、酸性磷酸酶及多酚氧化酶活性进行了研究。结果表明,两种不同林型下的土壤酶活性以及土壤养分含量之间存在明显差异,脲酶、酸性磷酸酶同土壤有机质、全氮、水解氮、速效磷之间呈极显著相关或显著相关,多酚氧化酶则相关不显著     

马尾藻多糖对南美白对虾免疫调节作用

[目的]研究马尾藻多糖对南美白对虾免疫功能的影响。[方法]用含不同比例(0、0.10%、0.15%和0.20%)马尾藻多糖的虾饲料喂养对虾14 d,测定虾血淋巴液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、酚氧化物酶和酸性磷酸酶的活性,计算攻毒感染后不同处理对虾存活率。[结果]含马尾藻多糖0.20%的虾饲料能极显著提高溶菌酶和酚氧化物酶活性,显著提高超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性和攻毒虾存活率,溶菌酶和酚氧化物酶含量分别达到(0.209±0.076)(、258.800±203.080)U/ml;含马尾藻多糖0.15%的虾饲料能极显著提高酚氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,显著提高溶菌酶活性和攻毒虾存活率,酚氧化物酶和超氧化物歧化酶含量分别达到(321.267±218.406)和(0.453±0.190)U/ml。[结论]马尾藻多糖能显著增强南美白对虾的免疫功能,其加入量为0.20%时效果最好。     

核型多角体病毒对斜纹夜蛾两种酶活性的影响

对感染核型多角体病毒的斜纹夜蛾(Spodoptera lituta)幼虫血淋巴酯酶和酚氧化酶进行了电泳分析,结果表明,两种酶的谱带在感染病毒后12h发生了明显的变化,导致酶带位移和新酶带的产生,在虫体内建立了新的酶系统;酚氧化酶比活性在感染核型多角体病毒后12 h最低,48h达到最高点.     

魔芋葡甘露寡聚糖硫酸酯对南美白对虾免疫功能的影响

在南美白对虾(Penaeus vannamei)饲料中分别添加魔芋葡甘露寡聚糖硫酸酯2 g/kg和β-葡聚糖2 g/kg,测定组织溶菌活力、血清酚氧化酶活性和超氧化物歧化酶活性,探讨魔芋葡甘露寡聚糖硫酸酯和β-葡聚糖对南美白对虾体内相关免疫酶活性的影响。结果表明,饲料中添加魔芋葡甘露寡聚糖硫酸酯、β-葡聚糖均显著提高了南美白对虾体内溶菌活力、酚氧化酶活性及超氧化物歧化酶的活力,提高机体抗病能力。     

枇杷多糖对草金鱼免疫特性的影响

研究枇杷多糖对草金鱼Carassius auratus免疫功能的影响,为水产动物病害的防治及充分利用枇杷资源提供依据。以草金鱼为试材,通过注射的方式免疫草金鱼,研究枇杷多糖对草金鱼超氧化物歧化酶、溶菌酶、酚氧化酶、白细胞吞噬率的影响,结果表明:注射枇杷多糖质量浓度为1.0mg·mL~(-1),免疫21h时草金鱼血液SOD、溶菌酶活性均达到最大,分别为37.8U和128U;注射枇杷多糖质量浓度1.5mg·mL~(-1),免疫28h时,草金鱼血清酚氧化酶活力和白细胞吞噬率均达最大,分别为4.1U、55.68%,说明枇杷多糖可以提高草金鱼的免疫功能。     

黄唇蜾蠃蜂蜂毒的毒性特征研究

通过分析黄唇蜾蠃蜂蜂毒中的蛋白质组分,发现SDS-PAGE可以分离出5条主要的蛋白质带.酶活力分析显示,黄唇蜾蠃蜂蜂毒和已研究过的其他胡蜂蜂毒一样,也具有透明质酸酶和磷脂酶A的活性,但蜂毒中没有检测到酯酶、磷脂酶C和酚氧化酶活性,也不含有酚氧化酶抑制因子.由此推测,黄唇蜾蠃蜂的蜂毒仅具有较弱的过敏活性.利用寄主斜纹夜蛾幼虫进行生理学活性分析证实,体腔注射黄唇蜾蠃蜂蜂毒不能引起寄主昆虫的麻痹反应,但脑部注射一个毒腺当量的蜂毒就会引起所有受试个体产生麻痹反应,但用胰蛋白酶处理后,蜂毒即失去麻痹活性.表明:黄唇蜾蠃蜂蜂毒的麻痹活性依赖于其蛋白质组分,而活性组分的作用靶标位于寄主昆虫的中枢神经系统.     

牛耳枫提取物对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用

 【目的】筛选对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua（Hübner)）酚氧化酶具有高抑制活性的化合物,寻找新型害虫控制剂的线索。【方法】以牛耳枫（Daphniphyllum calycinum Benth.）提取物Deoxycalyciphylline B和Methyl homosecodaphniphyllate为抑制剂,采用酶标仪微量法研究了其对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制活性及抑制类型。【结果】Deoxycalyciphylline B和Methyl homosecodaphniphyllate对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制中浓度(IC50)分别为2.439 mmol?L-1和0.879 mmol?L-1,2种化合物均为典型的可逆竞争型抑制剂,抑制常数（Ki）分别为2.051 mmol?L-1和1.269 mmol?L-1。【结论】2种生物碱对甜菜夜蛾酚氧化酶具有较好的抑制活性,可以以这2种化合物或其类似物为模板指导酶抑制剂的分子设计,是寻找新型害虫控制剂的重要途径。