基于PK15细胞的猪圆环病毒2型全悬浮培养工艺

【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺（病毒种毒来源、MOI及收获时间）,为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆（PK15-1C8、2F11、1E5）按照1×10⁶细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒（来源于贴壁细胞或悬浮细胞）,摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收获时间（48、72、96、120h）,确定PCV2最佳生产工艺。【结果】（1）贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×10⁶/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×10⁶/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;（2）3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到10^6.4TCID₅₀/mL,克隆PK15-2F11（10^5.5TCID₅₀/mL）、PK15-1E5（10^5.6TCID₅₀/mL）,3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆（10^4.7TCID₅₀/mL）,但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;（3）使用贴壁细胞来源的种毒（10^6.4TCID₅₀/mL）感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为10^6.5TCID₅₀/mL。以来源于悬浮细胞的种毒（10^6.3TCID₅₀/mL）感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达10^7.3TCID₅₀/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×10⁶/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达10^7.3TCID₅₀/mL,可用于工厂化疫苗生产。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒HN-LD株分离鉴定及部分毒力基因遗传进化分析

为了解湖南省伪狂犬病毒（PRV）病原特征及遗传变异情况,从湖南娄底某猪场采集疑似感染伪狂犬病（PR）病料,通过细胞传代、PCR鉴定、间接免疫荧光试验（IFA）等进行病毒分离鉴定;对该毒株的gC、TK和gE基因进行PCR扩增及测序,分析其变异情况。结果表明,临床病料接种PK15细胞后有1份样品出现细胞病变,经过PCR和IFA鉴定结果表明分离的毒株为PRV（命名为HuN-LD株）,盲传第6代病毒的滴度为10^7.5 TCID₅₀/mL。与参考PRV毒株相比,该毒株gE、TK和gC基因序列与国内流行变异株对应序列同源性最高,与其他毒株同源性相对较低。基于gC基因序列构建的系统进化数分析结果表明,该毒株与国内2011年后流行变异株亲缘关系最近,属于同一分支,但与国外流行的毒株（NIA3和Becker等）相隔较远,属于不同分支。提示成功分离得到1株PRV变异株,该结果可为湖南省PRV流行病学研究及疫苗研发等提供科学依据。     

四株猪伪狂犬病毒株的分离鉴定与主要毒力基因分析

猪伪狂犬病毒(PRV)的流行对中国养猪业造成巨大损失,而2011年后许多已免疫PRV疫苗的猪场频繁出现gE抗体转为阳性现象,感染猪出现PRV的临床症状,并出现所谓的“流产风暴”,学者们怀疑PRV的重新流行与病毒毒力增强和基因变异有关。为了解PRV变异情况,从各地疑似PRV阳性病料中,通过PK-15细胞分离出4个毒株,对毒株传代培养,进行TCID₅₀与LD₅₀测定,对主要毒力基因gB、gC、gE和TK进行扩增测序后分析,确定该4株病毒为PRV株,分别命名为FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株,滴度分别为10^-6.63、10^-7.08、10^-8.10、10^-7.18 TCID_50s·0.1mL^-1,对Balb/c小鼠的LD₅₀分别为10^2.17、10^2.72、10^3.44、10^3.51 TCID_50s,可见FJ01株的毒力最强。对4个毒株的毒力基因与其他PRV毒株进行同源性比对并建立进化树,FJ01株、FJ03株、MS2018株与中国近几年流行的变异毒株如HNX株、HNB株、JS-2012株等在一个大进化分支上,亲缘性较近,而与疫苗株Bartha-K61、SA215等,国际经典毒株Becker、Kaplan等亲缘性较远,变异较大。YK株与国际毒株亲缘性更近,其原因有待进一步探索。     

6种中药成分对猪传染性胃肠炎病毒的体外抑制作用

【目的】为探讨连翘苷等6种中药成分抗猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗TGEV的药物筛选提供依据。【方法】利用动物细胞培养技术,采用MTT比色法和细胞病变(CPE)观察法相结合,测定连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚6种中药成分不同浓度下对猪睾丸细胞（ST）的毒性作用,通过观察细胞CPE情况,确定药物对细胞作用的最大安全浓度;同时测定病毒的TCID₅₀,用细胞维持液配成100·TCID₅₀病毒悬液备用;将6种药物在最大安全浓度范围内连续2倍倍比稀释后,分别采用先感染病毒后加药、先加药后感染病毒、药与病毒混合后感染细胞3种不同作用方式进行体外增殖抑制试验,各试验组均设置正常细胞对照组和病毒对照组,每组设置3个重复,通过酶标仪测得630 nm处OD值,计算出不同作用方式下中药成分分别对TGEV的抑制率,筛选出抗TGEV活性较好的中药成分,并分别记录抗病毒效果最佳时药物的浓度;6n>种中药成分与病毒作用后,测定TGEVRT-PCR鉴定各个药物单体对病毒RNA合成的抑制情况,进一步明确各中药成分对TGEV的抑制作用。【结果】连翘苷、连翘苷元、绿原酸、咖啡酸、丁香酚、丹皮酚的最大安全浓度分别为320、200、80、125、100、200 μmol·L^-1;抗病毒效果最佳时药物的浓度分别为：160、100、20、62.5、25、100 μmol·L^-1。根据Karber法计算出初始TGEV的TCID₅₀为10^-6.25/0.1 mL;6种中药成分对TGEV在ST细胞上均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸浓度为62.5 μmol·L^-1时与100·TCID₅₀病毒混合作用后的病毒增殖抑制效果最好,相互作用72 h时,细胞形态依然能够保持圆滑、无固缩、完整,且细胞间轮廓清晰,仅有少量细胞脱落、死亡;此时测上清病毒的TCID₅₀为10^-3.75/0.1 mL,结果显示咖啡酸组病毒含量比病毒对照组10^-6.45/0.1 mL差异极显著（P＜0.01）;通过酶标仪测得630 nm处OD值计算出抑制率能够达到84.4%,咖啡酸直接灭活病毒作用极其显著。其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚,其病毒滴度分别为：10^-4.75、10^-5.55、10^-5.55、10^-5.65、10^-5.75/0.1 mL,但是这几种中药成分对病毒的抑制作用不够显著,抑制率大多在50%以下。另外,各中药成分对TGEV在ST细胞上的增殖抑制作用均为对TGEV的直接灭活作用最好,其次为对TGEV吸附阻断作用,最后为对TGEV的复制阻断作用。RT-PCR鉴定中药成分对病毒抑制作用,结果显示咖啡酸组条带与病毒对照组相比较暗,病毒效价较低,对病毒抑制作用效果显著;其次是连翘苷、连翘苷元、绿原酸、丹皮酚及丁香酚。【结论】6种中药成分在ST细胞上对TGEV均有一定的增殖抑制作用,其中咖啡酸直接灭活病毒作用最显著,有望被开发成抗病毒药物。     

新型鸭呼肠孤病毒在DF-1细胞系中的增殖特性

为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID₅₀)、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRV σC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID₅₀为1×10^-7.90·(0.1mL)^-1。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。     

盐度、饵料密度对长肋日月贝滤水率的影响

利用静水法研究了不同饵料密度梯度（0.5×10⁵、1.0×10⁵、1.5×10⁵、2.0×10⁵、2.5×10⁵个/mL）和不同盐度梯度（27、30、33、36、39）对壳长为60.40（±2.06）mm的长肋日月贝滤水率的影响。结果表明,饵料密度和盐度对长肋日月贝的滤水率有显著影响。以亚心型扁藻为饵料,在适宜的饵料密度范围内长肋日月贝的滤水率随着饵料密度的增加而增大,但当扁藻浓度达到1.0×10⁵个/mL时,滤水率（FR_Q）与饵料密度（Q）间呈负相关,其拟合方程为FR_Q=2.288Q^-0.71（R²=0.987）,滤水率开始迅速下降。长肋日月贝的滤水率（FR_s）开始随着盐度的升高而升高,在27～33之间存在最大值,然后随盐度的升高而下降,以个体数量计,与盐度（S）间的相关关系为FRs=-0.0110S²+0.7204S-11.2741（R²=0.8913）;如以单位体重计算,则可表示为FRs’=-0.0122S²+0.7881S-12.213（R²=0.885）;通过公式推算盐度为32.7时,滤水率达到最大、为0.521 L/h·ind。     

球孢白僵菌 GqBb 的分离、鉴定及其对 松果梢斑螟幼虫的致病性研究

为了探寻对松果梢斑螟有高致病性的病原微生物,本研究分离培养了采自秦皇岛北戴河区的感染松果梢斑螟幼虫病原物,结合菌种形态特征及 ITS 序列分析鉴定明确了其主要致病菌种,测定了其致病力。结果表明,该菌株为球孢白僵菌（编号 Gq-Bb 菌株）,当孢子悬浮液浓度从 1×10⁴孢子 /mL 逐步提高到 1×108 孢子 /mL时,其对各虫龄松果梢斑螟幼虫的致病性逐渐增强。当浓度为 1×10⁸孢子 /mL 时,其 1 龄和 2 龄幼虫的累计校正死亡率均达到 100%,3 龄、4 龄和 5 龄幼虫的分别为 96%、90% 和 77.33%。1 ～ 5 龄幼虫的 LC₅₀值分别为1.26×10³、1.90×10³、2.99×10³、2.12×10⁴、2.12×10⁵孢子/m L,LT₅₀分别为4.34～2.57、4.91～2.78、5.19～2.78、5.73 ～ 2.99和 6.44 ～ 3.64 d,...     

大豆高隆象致病球孢白僵菌菌株BEdy1的鉴定及毒力测定

【目的】大豆高隆象（Ergania doriae yunnanus）是我国南方大豆田间主要害虫之一。本研究旨在明确一株高隆象自然致病真菌的种类及其生物学特性,并测定该菌株对大豆高隆象成虫的毒力,为大豆高隆象的生物防治提供新材料。【方法】对采集的真菌进行分离、纯化培养,形态学观察;提取真菌DNA进而扩增rDNA-ITS,利用BLAST比对和系统进化树构建,鉴定田间致高隆象自然死亡的真菌种类;设置不同培养温度,通过十字交叉法和血球计数板方法测量计算真菌生长速率和产孢量;配置不同浓度的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BEdy1孢子悬浮液,采用浸虫处理法测定对大豆高隆象的毒力,与商品化球孢白僵菌产品LH毒力进行对比;大豆叶片喷施BEdy1孢子悬浮液,评价高隆象取食后的致死效果。【结果】致使高隆象田间自然发病死亡的真菌为球孢白僵菌,菌株命名为BEdy1。该菌株在22—28℃有较高的生长速率,26℃下生长速率最高,达4.34 mm·d^-1;在20—26℃有较高的产孢量,22℃下产孢量最大,为4.63×10⁶孢子/mm²。浓度为1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷和1.0×10⁸孢子/mL的BEdy1孢子悬浮液处理高隆象成虫10 d,死亡率分别为49.33%、77.33%、88.67%和98.00%,对照死亡率仅为10%。1×10⁸孢子/mL孢子悬浮液处理下,LT₅₀为（6.79±0.13）d,僵虫率为74.67%,发病严重度最高。10 d的LC₅₀和LC₉₅分别为4.80×10⁴和3.57×10⁷孢子/mL。浓度为1×10⁸孢子/mL的商品化球孢白僵菌产品LH处理高隆象成虫,10 d死亡率为58.00%,僵虫率为4.67%,极显著低于同浓度的BEdy1处理。大豆叶片喷施BEdy1孢子悬浮液后喂食高隆象,10 d死亡率为100%,僵虫率为63.33%,LT₅₀为（5.27±0.35）d。【结论】适当环境条件下,球孢白僵菌菌株BEdy1生长速度快,产孢量高,对大豆高隆象成虫有很高的致死率,具有较大的开发应用潜力。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like分离株致病力分析

为探究天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的流行情况,从天津市某猪场发病猪肺脏组织中分离到 1 株PRRSV,扩增其 Nsp2 基因,核苷酸序列比对结果显示该病毒属 NADC30 分支,与 TJnh1501 株同源性最高,命名为 TJ18114 株,并对其感染细胞能力和对猪的致病力进行了研究。结果显示：该毒株能够在 Marc145 细胞上稳定增殖,引起明显的细胞病变,最佳收获时间为 72 h(0.1MOI 接种),TCID₅₀为 10^6.445·mL^-1;用 2×10⁵TCID₅₀·头^-1的剂量经肌肉注射结合鼻腔喷雾方式接种 45 d 杜长大三元猪,猪只感染后 24 h 体温升高至 40 ℃以上,血液中病毒载量达 10^7.3copies·mL^-1;感染后 7 d PRRSV 抗体阳转率 100%;感染后 15 d 猪只消瘦、咳喘,剖检可见间质性肺炎,显微病理观察提示弥漫性肺泡萎缩、炎性浸润;PRRSV...