从原始生殖细胞分离克隆牛胚胎干细胞的研究

从５～１３周龄的牛胎儿生殖嵴及其周围组织采用与其儿成纤维细胞共培养的方式分离得到大量原始生殖细胞（ＰＧＣｓ）集落。这些集落的细胞经多次克隆传代具有胚胎干（ＥＳ）细胞的诸多特征,如有连续传代的能力（有两个胎儿分别传至６代和８代）,细胞集落有典型鸟巢状结构。ＡＫＰ染色阳性,体外分化实验具有形成类胚体力能力。上述表明该细胞具有多能性,类似ＥＳ细胞。     

影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素

探讨胚龄培养液、细胞因子、饲养层细胞等因素对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响。以4～13周龄流产胎儿生殖嵴或性腺为材料，小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、人胎儿成纤维细胞(hEF)、STO细胞和牛胎儿成纤维细胞(bEF)作饲养层，高糖DMEM(Dulbecco's minimum Eagle’s medium)为基础培养液，添加10^-4mol／L 2Me(2-巯基乙醇)、胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBS)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞冈子(SCF)等为培养液，探讨影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素。结果表明7～12周流产儿适于人类胚胎生殖细胞的分离克隆；人类胚胎生殖细胞体外培养以添加15％FBS为宜：添加4ng／mL LIF 4ng／mL bFGF 20ng／mL SCF能明显改善人类胚胎生殖细胞的分离克隆；MEF、STO、bEF和hEF可提高人原始生殖细胞(PGCs)的贴壁率，能促进PGCs源的人类胚胎干细胞(ES)的分离效率；以MEF作为饲养层效果较好。     

昆明小鼠胚胎干细胞建系的初步研究

以昆明小鼠（Mus musculus）为材料,利用超数排卵获得小鼠扩展囊胚、孵化囊胚。为了研究小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells,mESC）分离和传代的影响因素,设计两个实验：（1）不同孕期（3．5d或4．5d）的囊胚对胚胎干细胞分离效率的影响;（2）第5代后,不同传代方法（机械法或酶消化法）对mESC传代的影响。结果显示：在3．5d孕期时,胚胎为扩展囊胚,在4．5d时为孵化囊胚,扩展囊胚在贴壁率、原代克隆形成率差异不显著,从在继代培养上显著高于孵化囊胚（P〈0．05）;第5代后用机械法或胰酶消化法传代对mESC的维持没有明显差别,但从克隆的形态上看,酶消化法优于机械法。最后,本研究从扩展囊胚组中成功获得了一株mESC,该mESC碱性磷酸酶染色呈强阳性,经RT-PCR分析显示表达Oct4、Sox2,核型为正常40XY。     

玻璃化冷冻牛胚胎的分割移植实验初报

1 材料 供体牛为河北省临漳县狄丘牛场的西杂母牛和河北省邯郸市牛奶公司的中国荷斯坦母牛.受体牛为中国北方黄牛和中国荷斯坦青年母牛.促卵泡生成素(FSH)由中国科学院动物研究所产纯化FSH(批号:980001).玻璃化溶液为含40 %乙二醇、18 %聚蔗糖和0.3 mol蔗糖的mPBS液,即EFS40. 冲卵液为mPBS液.胚胎分割仪为瑞士产Leiz分割仪.     

不同添加物对分离昆明系小鼠胚胎干细胞的影响

以昆明系小鼠(Mus musculus Km)胚胎为材料,以丝裂霉素(10 μg/mL)处理的MEF为饲养层,研究了在胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)培养液中分别添加血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和FBS PD98059(50 μgol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、内细胞团(inner cell mass,ICM)集落形成及ESCs分离培养的影响.结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,胚胎贴壁率显著低于添加FBS(P<0.05),ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著(P>0.05),2～5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS(P<0.05),2株ESCs传到7代;在ESCs培养液中添加FBS PD98059,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1～5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS(P<0.05);用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1～5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/LEDTA(P<0.05).实验结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS PD98059更适合用于分离培养昆明系mESCs,用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA.     

国产丝裂霉素处理的STO细胞作为饲养层培养牛胚胎干细胞

寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义.本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠(Mus musculus)成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞)作为饲养层培养牛胚胎干细胞,为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据.用10、15、20、30和40 μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3.0和4.0 h的STO细胞;形态学观察不同代次STO细胞生长状态,并对生长在以STO细胞为饲养层的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色(AKP)、阶段特异性胚胎细胞表面抗原-4(OCT-4)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫组化检测、体外分化形成拟胚体等实验.结果显示,当丝裂霉素的浓度为15 μg/mL处理3.0 h可有效的抑制细胞分裂;STO细胞在5～10代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4和SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体.结果证明使用国产丝裂霉素能有效地处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能保持未分化状态,可以作为常规饲养层培养牛胚胎干细胞.     

不同添加物对分离昆明系小鼠胚胎干细胞的影响研究

本试验以昆明系小鼠胚胎为材料,以丝裂霉素（10μg/mL）处理的MEF为饲养层,研究了在ESCs培养液中分别添加KSR、FBS、FBS+PD98059 (50 μmol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、ICM集落形成及ESCs分离培养的影响。结果表明,在添加KSR的ESCs培养液中,胚胎贴壁率显著低于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05）,但ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著（P>0.05）,2~5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS的ESCs培养液（P＜0.05）,2株ESCs被传到7代;在添加PD98059+FBS的ESCs培养液中,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1~5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS的ESCs培养液（P＜0.05）;用0.5 g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1~5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA（P＜0.05）。结论：在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS+PD98059更适合用于分离培养昆明系小鼠ESCs,用0.5g/L胰酶+0.2g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L+0.2 g/L EDTA。     

牛胚胎的多代克隆

牛胚胎多代克隆的目的是通过重复细胞核移植产生大量的胚胎和牛犊。现已建立了一些重要的方法,例如：采用体外成熟的卵细胞为南受体;第二次减数分裂未期法核的先进技术;采和体外成熟,体外受精和体外培养形成的胚胎以及经冷冻保存的胚胎为核供体;核移植胚体外培养可发育至囊胚期;克隆胚可冷冻长期保存等。迄今已连续克隆６代获得囊胚期胚胎,移入受体母牛产生了第１～３代的克隆牛。从１枚牛胚胎通过３代克隆获４３枚胚胎,通过     

牛早期胚胎性别鉴定体系的建立和优化*

根据牛SRY基因5’调控区序列设计合成了2对巢式PCR引物作为公牛特异的性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计合成了l对引物作为内标基因引物，建立了牛早期胚胎性别鉴定的PCR反应体系，同时对微量牛胚胎细胞DNA的提取方法、巢式PCR和常规PCR的灵敏度进行实验，以便建立适合在生产实践中应用的牛胚胎性别鉴定技术。结果表明，设计使用的性别鉴定引物公牛特异，所有引物牛特异。煮沸法和反复冻融法都可应用于微量牛胚胎细胞DNA的提取。实验所使用的巢式PCR只要10个以上细胞就可看到扩增结果，适合在胚胎性别鉴定中使用。在建立了胚胎性别鉴定的PCR反应体系后，鉴定了10枚奶牛胚胎的性别，目前已产下两头犊牛，其实际性别和鉴定结果相一致。     

快速冷冻牛体外受精胚胎

本文研究不同类型的防冻剂及其浓度对快速冷冻牛胚胎的效果。试验Ⅰ：７日龄囊胚先分别放入含１０％（Ｖ／Ｖ）甘油或１０％（Ｖ／Ｖ）乙二醇改良的磷酸盐缓冲液（ＰＢＬ）中，室温下平衡１０ｍｉｎ。然后，分别移入１．５ｍｏｌ／Ｌ，２．０ｍｏｌ／Ｌ甘油或２．０ｍｏｌ／Ｌ，３．０ｍｏｌ／Ｌ乙二醇＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖ＰＢＬ液中，１０ｍｉｎ后将胚胎放进冰箱的结冰层（约─２３℃），３５ｍｉｎ后直接投入液氮。冻后孵化率最高的处理组为１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（８２．４％），其极显著（Ｐ＜０．０１）地高于２．０ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（１５．４％），２．０ｍｏｌ／Ｌ乙二醇＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（６３．９％），３．０ｍｏｌ／Ｌ乙二醇＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖（３８．７％）。试验Ⅱ：７日龄胚胎先在１０％（Ｖ／Ｖ）甘油中平衡１０ｍｉｎ，而后，分别移入１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０，０．２５，０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，停留１０ｍｉｎ后快速冷冻。解冻后，胚胎分别用０．５，０．２５，０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖除甘油。结果表明：解冻液中的蔗糖浓度对胚胎的存活力无显著影响。当冷冻处理为１．５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖时，胚     

优化的小鼠STO细胞系重编程多功能干细胞的建立

研究鼠胚成纤维细胞系STO (SIM-6-thiogunanie-oualiain)诱导为多功能干细胞(induced pluripotent stem cells),(STO-iPSCs).通过磷酸钙法将连接有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4个转录因子的慢病毒载体FUW-OSKM转染293FT细胞包装病毒,然后用病毒感染STO细胞,以干细胞培养条件培养.挑取诱导15d的克隆并在有饲养层和无饲养层的培养体系中培养.对获取的STO-iPSCs进行生物学特性分析,具有典型胚胎干细胞的形态特征,碱性磷酸酶染色呈阳性;qPCR结果表明,表达很高的原癌基因Nanog和Oct4 mRNAs;免疫细胞化学表明,表达胚胎干细胞特异性标志Nanog和Oct4,并且能够体外诱导分化为神经细胞.实验获得了STO-iPSCs,建立了STO-iPSCs无饲养层培养体系.     

通过四倍体补偿技术从同一胚胎干细胞克隆中生产雄性和雌性小鼠

有条件的控制基因表达已经能对成年动物中基因的调控进行分析,例如学习、记忆以及癌症的发展过程。然而,控制基因的表达需要将多个实验设计的基因导入到某一单一的动物个体。但是,对于携带多个等位基因突变或转基因小鼠的生产,需要耗费大量的时间和劳动。在这里     

猪胚胎干细胞培养、分离和传代

摘要:利用五指山小型猪近交系不同发育阶段的早期胚胎为材料，探索猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)培养、分离、传代的影响因素，以选择猪胚胎干细胞建系的适宜条件。收集五指山猪第5～10 d胚胎(配种当天记为0 d)，以 STO细胞[STO细胞是来自SIM小鼠(S)胚胎对硫代鸟嘌呤(thioguanine,T)和乌本苷(ouabain,O)有抗性的成纤维细胞系]为饲养层，分别采用两种培养液: 杜氏培养液(Dulbecco's modified eagle medium ，DMEM) + 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+ 10 %新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）+1 000 IU/mL白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）+ 30 ng/mL干细胞生长因子（stem cell growth factor , SCF）+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)或DMEM + 10% NBS + 10% FBS + 1 000 IU/mL LIF + 30 ng/mL SCF。比较发现，培养液中是否加入bFGF对胚胎干细胞的培养无显著影响；实验共收集胚胎124枚，其中D5～6胚胎18枚，胚胎贴壁率为68.8% ，内细胞团出现率为6.3% ，未能传代；收集D7孵化囊胚27枚，贴壁率为100% ，内细胞团出现率为38.9% ，传代1次失败；D9胚胎18枚，贴壁率为100%，传代后ES细胞生长较缓慢；收集D10胚胎52枚，胚胎贴壁率为100%，传代率为100%，传代后可出现ES细胞克隆点；实验过程中比较了胚径对干细胞培养的影响，发现胚径越大，培养效果越好，胚径大于100μm,分离ICM后出现干细胞集落成功率达100%，并得到了AP染色呈阳性的传4代的ES细胞集落。     

自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展

原始生殖细胞（PGCs）是哺乳动物各级生殖细胞的祖细胞。PGCs在体外合适的培养条件下，可自我更新，形成具有ES特征的多能干细胞系，称作胚胎生殖细胞（EG细胞）。EG细胞高度类似于ES细胞，PGCs可作为哺乳动物ES细胞分离克隆的一个有效替代途径，本研究对自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展及其相关问题作一简述。     

基于茎直径变化的作物水分状况监测研究进展

对“利用茎直径变化监测作物水分”的研究进行了综述。自20世纪60年代开始,基于茎直径变化的作物水分状况监测指标体系研究经历了两个阶段,即茎直径变化与作物水势关系的定性研究阶段;考虑环境变化和植株正常生长的茎直径变化—作物水势之间动态量化阶段。此方法通过对作物体内水分的动态监测,并与计算机应用相配合,可以用于温室和大田条件下指导适时灌溉。     

丙戊酸对体外培养牛胎儿成纤维细胞周期的影响

丙戊酸(valproic acid,VPA)作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,能提高细胞内组蛋白乙酰化水平,影响基因的表达.为探讨VPA对体细胞生长的影响,本实验以牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞为研究对象,利用流式细胞技术探讨VPA处理牛体细胞对其细胞周期的影响,并利用Real-time PCR检测VPA处理后细胞转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因表达变化的影响.结果显示,体细胞经0.8、1.0和2.0mmol/L的VPA分别处理24、48和72 h后,随VPA浓度的增加,体细胞增殖减缓,细胞周期抑制在间期0/间期1 (G0/G1)期.对转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因表达量的检测表明,与未处理组相比VPA处理后细胞Oct4和Nanog的表达量提高,而Cdx2基因的表达量降低.研究结果表明,VPA处理能够改变成纤维细胞的生长特性和基因表达状态,本研究牛体细胞核移植胚胎表观重编程及发育研究提供了参考资料.