玉米干酒糟及其可溶物对仔鹅生长性能及肉品质的影响

本试验旨在研究饲粮中添加不同水平玉米干酒糟及其可溶物（ＤＤＧＳ）对仔鹅生长性能和肉品质的影响。选取 １６０只 ３周龄扬州鹅（母）,随机分为 ４个组,每个组 ４个重复,每个重复１０只鹅。对照组饲喂玉米 －豆粕型基础饲粮,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组玉米 ＤＤＧＳ占饲粮的比例分别为 １０％、２０％、３０％。在试验期每周末称量禁食 １２ｈ后的仔鹅体重,以重复为单位记录周采食量,在仔鹅 １０周龄末屠宰采样,分离胸肌和腿肌,测定仔鹅肉品质。预试期 １周,正试期 ６周（４～１０周龄）。结果表明：饲粮中添加玉米 ＤＤＧＳ对试验组的平均日采食量、料重比无显著影响（Ｐ＞０．０５）;５周龄时,试验Ⅰ组的体重显著高于试验Ⅲ组（Ｐ＜０．０５）,８、９周龄时,试验Ⅱ组的体重显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）,但在整个试验期间各组的平均日增重无显著差异（Ｐ＞０．０５）。试验组胸肌的 ｐＨ、肉色、剪切力、失水率与对照组无显著差异（Ｐ＞０．０５）。在脂质过氧化水平测试期第 １天,试验Ⅰ和Ⅱ组硫代巴比妥酸反应物含量显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）,在第４、５天,３个试验组均显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）,从整个测试期的每天测试结果看,各组间的硫代巴比妥酸反应物含量均有随着玉米 ＤＤＧＳ添加水平的增加呈先上升后下降的趋势。综上所述,在仔鹅的饲粮中添加至 ３０％的玉米 ＤＤＧＳ对仔鹅的生长和常规的肉品质指标无不利影响,但会提高仔鹅肌肉的脂质氧化水平,容易引起酸败。     

紫花苜蓿高温诱导启动子pMsMBF1c的克隆与功能分析

植物耐热性受复杂而精细的调控。热诱导启动子能经济、高效的激活或关闭耐热调节途径关键基因的表达,在植物功能基因组研究与现代分子育种技术中起十分重要的作用。以紫花苜蓿耐热候选基因MsMBF1c的编码序列为基础,采用酶切连接的方法分离获得了其上游1748bp序列,生物信息学分析发现该区域具有HSE与GATA结合位点等2个与植物耐热调节相关的保守模体,此外还有5个ABA应答元件(ABRE、MYB2、MIC2、CBF与DPBF)和2个MYB蛋白结合位点,说明MsMBF1c除了参与植物耐热性调节外,还可能参与其他抗逆性调节。构建pBI121-MsMBF1c::GUS双元载体转化野生型拟南芥,荧光定量分析热诱导后的转基因植物中GUS与AtMBF1c基因的表达发现其分别上调了5.4与4.8倍,并且高温诱导下转基因植株的组织化学染色分析同样证明MsMBF1c启动子显著受高温诱导。分离获得紫花苜蓿MsMBF1c启动子序列并转化拟南芥,并且从生物信息学、组织化学染色与基因表达等方面验证该序列能显著被高温诱导,为探讨紫花苜蓿耐热调控机制及通过分子生物技术改善紫花苜蓿耐热性提供理论支撑,最终为培育适应南方高温气候条件的紫花苜蓿新品种提供技术储备。     

紫花苜蓿高温诱导启动子pMsMBF1c的克隆与功能分析

植物耐热性受复杂而精细的调控。热诱导启动子能经济、高效的激活或关闭耐热调节途径关键基因的表达,在植物功能基因组研究与现代分子育种技术中起十分重要的作用。以紫花苜蓿耐热候选基因MsMBF1c的编码序列为基础,采用酶切连接的方法分离获得了其上游1748bp序列,生物信息学分析发现该区域具有HSE与GATA结合位点等2个与植物耐热调节相关的保守模体,此外还有5个ABA应答元件(ABRE、MYB2、MIC2、CBF与DPBF)和2个MYB蛋白结合位点,说明MsMBF1c除了参与植物耐热性调节外,还可能参与其他抗逆性调节。构建pBI121-MsMBF1c::GUS双元载体转化野生型拟南芥,荧光定量分析热诱导后的转基因植物中GUS与AtMBF1c基因的表达发现其分别上调了5.4与4.8倍,并且高温诱导下转基因植株的组织化学染色分析同样证明MsMBF1c启动子显著受高温诱导。分离获得紫花苜蓿MsMBF1c启动子序列并转化拟南芥,并且从生物信息学、组织化学染色与基因表达等方面验证该序列能显著被高温诱导,为探讨紫花苜蓿耐热调控机制及通过分子生物技术改善紫花苜蓿耐热性提供理论支撑,最终为培育适应南方高温气候条件的紫花苜蓿新品种提供技术储备。     

日本结缕草ZjNAC3基因的克隆与功能分析

从日本结缕草中克隆获得ZjNAC3基因,编码区全长1167bp,并获得含1622bp的启动子序列.保守结构域分析表明,克隆的ZjNAC3基因属于NAC转录因子家族.启动子分析表明,启动子中含有多个激素、胁迫响应元件.脱落酸(ABA)、乙烯(ETH)、茉莉酸甲酯(MeJA)、氯化钠(NaCl)、甘露醇(Mannitol)...     

牛IRX3基因启动子转录调控分析

旨在探究牛IRX3基因组织表达规律,并鉴定其启动子区关键转录因子,以期阐明其转录调控机制。本研究采集3头成年公牛心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、网胃、瘤胃、皱胃及睾丸组织,利用荧光定量PCR检测IRX3基因在不同组织中相对表达量。同时克隆牛IRX3基因1.8 kb启动子区序列并构建其启动子6个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,分别转染3T3-L1和C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,借助定点突变及siRNA干扰技术在3T3-L1细胞系内初步鉴定关键转录因子对IRX3基因的转录调控作用。结果表明,IRX3基因在牛13个不同组织中均有表达,且在肺、肾、心、皮下脂肪、背最长肌中高表达（P<0.05）。利用双荧光素酶报告载体检测到牛IRX3基因核心区域在-372/-42 bp。结合定点突变及siRNA干扰技术初步鉴定NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1转录因子对IRX3基因的转录活性有重要的调控作用。综上表明,牛IRX3基因在背最长肌和脂肪组织中表达量相对较高,其启动子1.8 kb区有8个CpG岛,核心区关键转录因子NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1位于CpG岛内且调控IRX3基因转录活性。本研究结果为探究IRX3基因在牛脂肪沉积过程中的分子调控机制奠定了重要理论基础。     

几个杨树木质部特异启动子片段表达载体的构建与功能分析

木质部纤维素合酶基因(CesA)在植物正常生长期的木质部特异表达,受到外界压力时可诱导在韧皮部表达,因而被用作杨树抗桑天牛转基因研究中的特异性表达启动子。将前期分离的CesA上游DNA片段JCesAP、YCesAP和MDCesAP分别替换植物表达载体pCAMBIA1302中的组成型启动子CaMV35S,构建成新的植物组织特异性表达载体pJCesAP-GFP、pYCesAP-GFP和pMDCesAP-GFP,然后采用农杆菌介导法转化烟草,均得到完整的再生烟草植株。经PCR初步检测证明目的基因已整合到烟草基因组中。荧光检测JCesAP、YCesAP和MDCesAP片段均能启动GFP蛋白的表达,在395 nm激发光下出现黄绿色荧光,显示3个CesA片段均具有在木质部特异表达的启动子活性。     

新牧1号苜蓿两种抗逆相关启动子的功能分析

前期已成功克隆了新牧1号苜蓿MvP5CS与MvNHX1基因和二者的启动子序列。在此基础上,本试验分别构建了含有Mvp5cs和Mvnhx1启动子的调控GUS报告基因的植物表达载体,并通过农杆菌介导法得到了含有Mvnhx1与Mvp5cs启动子的转基因烟草植株。PCR检测证明了两种启动子已稳定的整合到烟草基因组中;GUS组织染色证明两种启动子均具有启动基因表达的功能。通过测量GUS活性来探究两种不同的诱导型启动子在4种非生物胁迫下(干旱、盐、脱落酸、赤霉素)的表达活性。结果表明,1)Mvnhx1与Mvp5cs启动子均响应盐、脱落酸、赤霉素、干旱胁迫,与CaMV35S启动子相比,差异显著。2)Mvnhx1启动子在盐胁迫、脱落酸胁迫下所起诱导作用要优于Mvp5cs启动子。在48 h 100 mmol/L、150 mmol/L NaCl胁迫处理时,Mvnhx1启动子GUS活性分别是Mvp5cs启动子的2.03和3.23倍,差异显著。在25 μmol/L、 50 μmol/L ABA处理下,Mvnhx1启动子的活性整体高于另两种启动子,差异显著。3)Mvp5cs启动子在干旱胁迫、赤霉素胁迫所起诱导作用优于Mvnhx1启动子。干旱胁迫时,Mvp5cs启动子的GUS活性在36 h是同时间Mvnhx1启动子的2.22倍。70 μmol/L GA处理时,Mvp5cs启动子在36 h达到最大值,是同时间段Mvnhx1启动子的1.79倍。     

猪恒定链的原核表达及其分子结构与功能分析

为研究猪恒定链(Ii)分子结构与功能,通过PCR扩增编码完整Ii及其异构体的基因片段,克隆至T pMD18-T载体,在对目的基因进行测序及分析其基因与编码蛋白分子结构,确定功能域及其分子遗传变异的基础上,构建pET-32a-Ii重组载体,转化BL21进行诱导表达,并分析表达产物的免疫活性。结果显示,PCR扩增了645bp和837bp的Ii及其异构体编码基因,DNA序列分析其编码氨基酸分别为215个和279个,异构体Ii多出了64个氨基酸构成的Tg区;分子结构分析显示,猪Ii分子由胞内区、跨膜区和胞外区3部分组成,包含有内体定位基元、Ii-key、CLIP、TRIM等功能域,其中内体定位基元含有特征性L7I和PML17双亮氨酸基序,Ii-key、CLIP、TRIM氨基酸序列与人和小鼠Ii具有高度一致性。遗传变异分析表明,猪Ii分子与人、小鼠等哺乳动物的Ii同源性为62.7%~95.6%,与鸡、鸭、鸽、鹅等禽类Ii的同源性为48.7%~49.5%;空间结构分析显示,猪Ii有3个相似的α-helix构成,其间间隔由相似氨基酸构成的2个转角,转角关键位点氨基酸具有高度一致性;Ii编码基因在BL21细胞获得了有效表达,目的蛋白大小约41ku,Western blot和免疫荧光检测显示,表达产物具有良好的反应原性。试验成功获得了猪Ii及其异构体编码基因,明确了其功能区、分子遗传变异等特征,诱导表达获得了具有良好免疫活性的Ii重组蛋白,为进一步研究猪Ii分子结构与功能奠定了基础。     

组织特异性启动子的结构特征及其调控作用

植物组织特异性启动子能够调控优良基因在特定器官或组织中表达,具有与基因特异表达相关的结构元件。研究发现,其在调节植物生长发育过程、抵抗生物和非生物胁迫等方面具有重要作用。本文分类概述了近年来植物不同组织特异性启动子的结构特征及调控作用的最新研究进展,并对今后组织特异性启动子研究方向进行展望。     

柠条锦鸡儿CkNCED1基因启动子的克隆及表达分析

利用染色体步移(Genome walking)技术,克隆柠条锦鸡儿CkNCED1基因上游启动子序列。经顺式元件预测分析,该序列除基本的启动元件之外,还含有2个脱落酸诱导响应元件ABRE、此外还含有多个逆境相关的元件。将CkNCED1基因启动子区连接到pGWB533植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,GUS组织化学染色结果表明,CkNCED1基因在植物的叶、根、茎、花和角果的维管组织中均有表达,且在叶片中表达强度最高。以上研究确定了柠条锦鸡儿CkNCED1基因的表达部位和强度。进一步说明CkNCED1基因在ABA合成调控中发挥重要作用,为深入研究基因功能奠定基础。     

鸡传染性贫血病毒vp3基因在真核细胞中的表达与功能分析

为研究鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白在宿主细胞中的作用,本研究采用PCR技术从CIAV DNA中扩增出vp3基因,并将该基因克隆到p MD18-T simple vector中。经测序证实所克隆的vp3基因与CIAV CUX-1标准株相同。并将vp3基因亚克隆到真核表达载体p EGFP-N1中,构建了重组真核表达质粒p EGFP-vp3与p CMV-Myc vp3,转染BHK-21和293 T细胞,经RT-PCR、荧光显微镜以及Western Blot证实转染的真核细胞能够表达VP3蛋白。以台盼蓝染色法检测细胞死亡,结果表明,VP3蛋白具有较强诱导细胞死亡的作用。该结果为深入研究CIAV的致病机理奠定了基础。     

口蹄疫病毒3D基因的真核表达及其表达产物的功能分析

利用RT—PCR技术扩增口蹄疫病毒（FMDV）编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因，经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）中，重组质粒pcDNA3．1（＋）-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞。用纯化的目的蛋白进行Western—blotting鉴定，并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示，获得分子质量约55ku的单一3D基因表达产物，其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术，证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。     

马铃薯病毒诱导应答基因抑制消减杂交文库构建及分析

马铃薯病毒积累引起的种薯退化是马铃薯生产中造成产量和品质下降的重要原因之一。本研究以马铃薯病毒病携带植株叶片cDNA为试验组(Tester)、脱毒种苗叶片cDNA为驱动组(Driver),采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术构建了马铃薯病毒诱导应答基因的cDNA文库;为验证文库构建效果,从文库中随机挑取了98个阳性克隆经PCR验证后测序,获得了45条高质量的有效非重复序列;经与GenBank进行同源比对后发现,其中14条非重复序列属于马铃薯病毒基因序列,22条与已知基因序列同源性较高,9条无同源参考基因;选取文库中出现频率较高的2个ESTs(expressed sequence tag,表达序列标签)用qRT-PCR技术分析发现,其表达量受马铃薯病毒侵染的诱导。结果表明,该SSH文库构建较为成功,为进一步筛选与马铃薯病毒致病、防御相关的应答基因,解析马铃薯与病毒互作的分子机理,利用生物技术手段培育抗病毒马铃薯奠定了基础。     

梨树冠层光响应基因PpPRR5b的克隆与功能分析

连锁的转录-翻译反馈路径在调控生物钟输出途径中起重要作用,而伪应答调控蛋白PRR则是其关键的遗传组分。尽管PRR基因在非生物反应、细胞延伸和光周期开花反应等方面的调控作用已被证实,但它们在其它光相关的农艺性状(如光合作用)中的作用还有待进一步阐明。本研究从梨叶组织中克隆了一个拟南芥AtPRR5的同源基因,命名为PpPRR5b。该基因全长2019 bp,共编码672个氨基酸。PpPRR5b蛋白相对分子量为74.23kD,理论等电点为6.28,定位于细胞核,具有亲水性。二级结构预测结果显示,PpPRR5b主要以无规则卷曲为主(占60.01%)。烟草叶片瞬时表达结果表明,随着红光强度的增强,超量表达PpPRR5b基因的叶组织能显著抑制净光合速率、气孔导度及胞间CO₂浓度水平。本研究初步证实PpPRR5b具有响应光信号,抑制光合作用的功能。     

不同品种猪IGFBP-3启动子区突变位点筛查及分析

以军牧1号白猪、大白猪、东北野猪、巴马香猪和西藏小型猪为研究对象,通过PCR扩增5个品种猪IGFBP-3基因5′调控区序列(约2 000bp)并进行测序分析,来研究不同品种猪IGFBP-3基因启动子区序列的差异。同源性比对分析发现5个品种猪IGFBP-3基因5′调控区存在约50处突变;启动子预测发现在-185bp附近为核心启动子区的几率最大;突变共导致9处转录因子结合位点发生改变,其或可造成不同品种猪IGFBP-3表达量的差异,进而影响不同品种猪的体型大小。