紫花苜蓿ＷＲＫ转录因子基因的克隆与亚细胞定位

 ＷＲＫＹ 转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ 结合的方法获得１个紫花苜蓿ＷＲＫＹ 转录因子家族成员的ｃＤＮＡ 序列,命名为MsWRKY56。该序列长１２６７ｂｐ,包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框,编码３１７个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

长叶红砂RtMYB1基因的克隆及表达

MYB转录因子家族在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥着重要的调控作用。基于转录组测序数据,从珍稀泌盐盐生植物长叶红砂(Reaumuria trigyna)中克隆一个MYB转录因子基因,命名为RtMYB1。RtMYB1基因具有780bp的ORF(open reading frame)序列,编码236个氨基酸残基组成的蛋白。RtMYB1能够被盐、冷、高温、紫外照射(UV)和干旱(PEG)5种非生物胁迫诱导表达,这表明RtMYB1基因可能参与长叶红砂响应非生物胁迫的调节途径。本研究为深入了解长叶红砂的抗逆机理及发掘优异的抗逆基因奠定了基础。     

减蛋综合征病毒33K蛋白基因克隆及结构分析

纯化的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ水解、０．８％琼脂糖电泳后,回收各ＤＮＡ条带并克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ载体,建立了ＥＤＳＶ基因文库,对３３Ｋ蛋白基因进行了分析。本研究证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白基因含有２个外显子,与羊腺病毒（ＯＡＶ）３３Ｋ蛋白比较,Ｎ端编码产物的同源性为３０．８％,Ｃ端的为６０％。用ＲＴ－ＰＣＲ扩增３３ＫｍＲＮＡ和ｃＤＮＡ克隆及序列分析证实,ＥＤＳＶ３３Ｋ蛋白含有８２碱基（ｎｔ）的内含子,去掉内含子３３Ｋ蛋白基因能形成完整的ＯＲＦ,其编码产物由１７７氨基酸（ａａ）组成,推测分子质量为２．０６×１０４,与人５型腺病毒和ＯＡＶ的同源性分别为２８．１％和４４．７％。     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性敢管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列，应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２，分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行了ＰＣＲ扩增，结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增产生４５７ｂｐ的特异性片段，而ＴＫＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ     

鲈鱼视黄酸受体 α和视黄酸受体 γｃＤＮＡ克隆和基因表达分析

本文旨在研究鲈鱼视黄酸受体 α（ＲＡＲα）和视黄酸受体 γ（ＲＡＲγ）的结构及其基因的组织表达特点。采用反转录 ＰＣＲ和 ｃＤＮＡ末端快速克隆（ＲＡＣＥ）技术,从鲈鱼肝脏中克隆得到ＲＡＲα和 ＲＡＲγ全长 ｃＤＮＡ序列。检测鲈鱼肝脏、肌肉、心脏、眼、肠、肾脏、脂肪、脾脏、鳃和大脑 １０个组织中 ＲＡＲα和 ＲＡＲγ基因的表达情况。结果表明：１）鲈鱼 ＲＡＲαｃＤＮＡ全长２０９４ｂｐ,５′端和 ３′端的非翻译区分别为 １２４和 ６０８ｂｐ,开放阅读框为 １３６２ｂｐ,推测编码 ４５３个氨基酸,分子质量为 ５０．６４ｋｕ,理论等电点为 ８．２０。２）ＲＡＲγｃＤＮＡ全长 １６７１ｂｐ,其中包括 ３６ｂｐ的 ５′端非翻译区、１２９ｂｐ的 ３′端的非翻译区和 １５０６ｂｐ的开放阅读框,共编码 ５０１个氨基酸,分子质量为 ５６．２０ｋｕ,理论等电点为 ４．９６。３）鲈鱼 ＲＡＲα和 ＲＡＲγ都具有典型的核受体结构,两者氨基酸序列同源性高达 ６３．１％。鲈鱼的 ＲＡＲα和 ＲＡＲγ与红鳍东方有较高的同源性,分别为９６．９％和 ９５．２％。４）ＲＡＲα和 ＲＡＲγ基因在所有检测组织中均有表达,其中 ＲＡＲα基因在心脏和大脑中表达较少,在眼、鳃和肠中表达较高,而 ＲＡＲγ基因仅在鳃和脾脏中有较高表达。总之,本试验成功克隆了鲈鱼 ＲＡＲα和 ＲＡＲγ的全长 ｃＤＮＡ;鲈鱼 ＲＡＲα和 ＲＡＲγ有着典型的核受体结构,在各组织中广泛分布。     

传染性法氏囊病病毒A节段编码序列cDNA原克隆和序列分析

对反转录－聚合酶链反应扩增克隆的传染性法氏囊病病毒超强毒Ｈａｒｂｉｎ毒株的Ａ节段编码序列ｃＤＮＡ基因进行了核苷酸序列分析。结果，克隆的Ａ节段基因共３１０ｂｐ，包括两个完整的阅读框架ＯＲＦＡ１和ＯＲＦＡ２分别编码１０１２氨基酸的前体蛋白ＶＰ２－４－３和１４５氨基酸的ＶＰ５，两者有部分重叠。     

鸡IL-2基因的克隆及序列测定

应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，参照Ｓｕｎｄｉｃｋ发表的鸡白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ基因序列，利用在行设计合成的１对引物，从ＣｏｎＡ活化的５周龄ＨＷＬ－ＳＰＦ鸡脾细胞中，扩增出长４４５ｂｐ的鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因，以ＰＵＣ１１９为载体，克隆了扩增片段，经酶切鉴定及ＤＮＡ序列测定，确认为鸡ＩＬ－２基因，该序列与Ｓｕｎｄｉｃｋ报道的结果一致。对氨基酸的比较发现，鸡ＩＬ－２与牛ＩＬ－２     

传染性法氏囊病病毒A节段编码序列cDNA基因的克隆和序列分析

对反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）扩增克隆的传染性法氏囊病病毒超强毒Ｈａｒｂｉｎ毒株的Ａ节段编码序列ｃＤＮＡ基因进行了核苷酸序列分析。结果,克隆的Ａ节段基因共３１０１ｂｐ,包括两个完整的阅读框架ＯＲＦＡ１和ＯＲＦＡ２分别编码１０１２氨基酸的前体蛋白ＶＰ２４３和１４５氨基酸的ＶＰ５,两者有部分重叠。Ａ节段编码序列基因的克隆成功为分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

牛β—酪蛋白基因上游调控序列PCR扩增及克隆

采用蛋白酶Ｋ法从母牛肝中提取染色体ＤＮＡ,将其纯化后作为ＰＣＲ扩增模板。以引物设计软件从牛β－酪蛋白基因上游６００ｂｐ至第１个外显子设计引物,引物长度１９ｎｔ,跨度６３７ｂｐ。扩增产物电泳结果显示,在分子量Ｍａｒｋｅｒ６５７ｂｐ带附近,出现一明显亮带,这一结果与设计产物大小基本一致。用低温冷冻法纯化ＰＣＲ产物,煮沸裂解法提取载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫｓ＋质粒,ＥｃｏＲＶ酶切质粒ＤＮＡ,Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接ＰＣＲ扩增片段和质粒ＤＮＡ。将重组质粒ＤＮＡ转化到ＪＭ１０１大肠杆菌中,经筛选、酶切、测序鉴定,结果表明所克隆的片段为牛β－酪蛋白基因上游调控序列。     

禽呼肠孤病毒S1基因的扩增克隆与鉴定

利用反转录－聚合酶链（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,扩增出禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）Ｓ１１３３、１７３３长为５４０ｂｐ的Ｓ１基因片段。将扩增到的２个毒株的Ｓ１基因通过粘端连接分别克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ＋质粒中,用ＰＣＲ和限制性内切酶分析鉴定,表明获得２种重组质粒ＡＲＶ Ｓ１１３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ＡＰＶ １７３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ。