李付广团队发现抗棉花黄萎病新基因

<正>近日,中国农业科学院棉花研究所研究员李付广团队对陆地棉核糖体蛋白基因GhRPL18A-6在棉花抗黄萎病过程中的功能和机制进行了系统研究。该研究团队发现,该基因能调控细胞壁合成、木质素合成等与抗病相关通路基因的表达,并在多个生长阶段提高转基因棉花的抗性水平。该研究为解析棉花黄萎病抗性提供了思路,并为抗病品种分子育种提供了新的抗病基因及种质资源。棉花黄萎病堪称棉花"癌症",陆地棉遗传背景狭窄,缺乏黄萎病抗性种质资源材料,通过传统育种方法     

陆地棉抗黄萎病种质创新与抗病基因挖掘

抗病种质在抗病育种中的地位不可替代。远缘杂交材料创新是陆地棉黄萎病抗性种质创制的重要基础;基因工程提供了创造变异的新技术,但由于抗病机制复杂,导入一、两个主基因的效果还不明显;采用分子生物学技术揭示棉花对黄萎病的抗性机制,发掘棉花抗病基因和病程相关基因,有助于剖析棉花-黄萎病菌互作机制。本文概述了陆地棉抗黄萎病种质创制、抗病品种选育的成就,介绍了棉花黄萎病抗性机理与功能基因发掘等方面的最新进展,为抗病分子设计育种提供理论支持。     

一个受黄萎病菌诱导的海岛棉功能基因GbVWR的克隆与表达

黄萎病是一种土传真菌维管束病害,严重影响棉花产量和品质。挖掘抗黄萎病相关基因对于棉花抗黄萎病遗传改良具有重要意义。本研究通过筛选黄萎病菌胁迫下的海岛棉全长cDNA文库和陆地棉SSH文库,获得一个与黄萎病菌胁迫相关的基因,命名为GbVWR。生物信息学特征和基因表达分析表明,GbVWR基因全长520 bp,开放读码框198 bp,编码65个氨基酸残基组成的蛋白,理论等电点为5.32,包含一个信号肽和一个跨膜区,是一种分泌蛋白。GbVWR基因可以诱导表达7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到真菌激发子响应、激素响应、伤口响应及黄酮生物合成基因调节等应答元件。GbVWR基因在海岛棉根中表达最高,茎中其次,叶中最低。受黄萎病菌诱导后,GbVWR基因在接菌后2 h可对黄萎病菌作出应答反应。此外SA、ET和GA均可显著诱导GbVWR基因的表达。初步推断GbVWR是海岛棉抵御黄萎病菌过程中一个新的功能基因,通过参与多种激素信号途径发挥功能     

棉花GbSTK基因调控开花和黄萎病抗性的功能研究

棉花是重要的经济作物,实现既抗病又早熟是棉花重要的育种目标,但棉花抗病与早熟基因之间的关联性研究报道甚少。本课题组前期鉴定到一个响应黄萎病菌诱导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因GbSTK,可以提高转基因拟南芥的黄萎病抗性。本研究发现多个抗病棉花品种中STK基因的表达量显著高于感病对照品种H208。在抗病品种农大601中沉默STK基因,沉默植株在接菌后20d,其黄萎病抗性显著降低,病情指数由27.5(耐病)升高到63.2(感病),表明该基因正向调控棉花黄萎病抗性。对转GbSTK基因拟南芥表型鉴定发现,其开花时莲座叶片数平均为7.5个,显著低于空载体对照植株(11.9个),转基因植株开花时间较对照平均提早5~7 d。进一步对拟南芥开花途径标志基因FT、SOC1和LFY的转录水平检测发现,转基因不同株系中FT和SOC1的表达水平显著高于对照植株,而LFY基因的表达受影响较小,表明STK基因可以影响开花关键基因FT和SOC1的表达,进而调控植株提早开花。基于酵母双杂交互作蛋白筛选试验,初步获得30个与GbSTK具有互作关系的候选蛋白,为进一步揭示GbSTK的分子调控网络奠定了基础。本研究首次鉴定出可同时提高黄萎病抗性和提早开花的一个功能基因,为棉花抗病早熟遗传改良提供了参考依据。     

棉花抗黄萎病分子机制研究进展

黄萎病(Verticillium wilt)已严重影响棉花的可持续生产,研究并明确棉花对黄萎病的抗病机制对于黄萎病的防控至关重要。本研究从诱导抗病性(induced disease resistance,IDR)、抗病相关基因介导的抗病性(resistance related gene induced disease resistance,RGIR)以及小RNA的抗病机制(micro RNA mediated disease resistance,MDR)这3个方面综述了棉花黄萎病抗性机制的研究进展,概述了激发子、抗病基因和转录因子的分类与特点以及诱导免疫和理想诱导物的特点;并在棉花抗病基因的发掘上重点作了展望,以期对棉花抗病育种提供理论参考。     

海岛棉品种根部黄萎病菌诱导表达全长cDNA文库的构建

以海岛棉品种 712 4黄萎病菌接种前后的根部组织为材料 ,构建的黄萎病菌诱导表达的全长c DNA文库。该文库的克隆数目为 1.15×10 7pfu,插入片段的大小在 0 .5～ 6kb之间 ,文库的阳性克隆子的比例为 84.7%。该文库可以用于抗黄萎病基因的克隆及其相关研究。在文中作者同时对棉花的文库构建所应该注意的事项进行了讨论。     

陆地棉漆酶基因家族鉴定及在黄萎病菌胁迫下的表达分析

黄萎病是降低棉花产量和品质较为严重的维管束病害。棉花在抵抗病原菌的过程中,抗病基因起着尤为重要的作用。漆酶是一种多功能氧化酶,在植物木质素合成和提高植株抗逆性等方面发挥着重要作用。高质量版本的基因组是提升基因家族分析准确性的必要条件。本研究以目前最新的陆地棉TM-1高质量版本基因组为参考,通过生物信息学分析鉴定了陆地棉基因组中的Laccase(GhirLAC)基因家族,并对其进行了理化性质、基因结构、染色体定位以及在黄萎病胁迫下的表达模式分析。结果表明,陆地棉TM-1基因组中共包含83个GhirLAC家族成员,分布在24条染色体上,所有GhirLAC蛋白均定位在胞外,且具有相同/相似的保守基序。系统发育树分析显示,GhirLAC基因家族成员可分为7个亚组。结合黄萎病胁迫下棉花转录组数据,将GhirLAC基因家族各成员的表达分为3种模式,其中第1类和第2类GhirLAC基因在黄萎病菌胁迫下分别呈现有规律的表达量升高和降低,推测这些基因在棉花抗黄萎病反应中发挥重要功能。荧光定量PCR结果表明,GhirLAC02(GhLAC4)、GhirLAC38(GhLAC11)和GhirLAC20(GhLAC12)3个候选基因均受黄萎病菌诱导表达,其表达趋势与转录组数据相吻合。本研究为以后深入解析棉花GhirLAC基因的抗病功能及分子机制奠定基础。     

利用WGCNA鉴定棉花抗黄萎病相关基因共表达网络

加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)作为一种典型的系统生物学方法,可用来鉴定协同表达的基因模块,探索模块与目标性状之间的生物学相关性,并挖掘网络中的核心基因。黄萎病(Verticillium wilt)可严重降低棉花(Gossypium spp.)的产量及品质,因此研究抗病基因及抗病机制,对于棉花抗病育种工作具有重要意义。本研究以黄萎病菌侵染不同时间点的海岛棉(Gossypium barbadense)幼苗根尖转录组数据为基础,分析其差异表达基因,并选取在不同样本之间表达水平变异最大的前50%基因(共35,647个)进行WGCNA。结果表明,在黄萎病菌侵染条件下,共有22,850个基因差异表达,其中4685个为所有侵染时间点共有的差异基因。共鉴定到18个基因共表达模块,其中5个为抗黄萎病相关特异性模块(black、mediumpurple3、darkolivegreen、plum3模块分别与侵染2 h、6 h、48 h、72 h时间点正相关;mediumpurple2与侵染2 h时间点负相关)。GO和KEGG富集分析表明,特异性模块可以富集到有生物学意义的富集结果,如刺激响应、钙离子结合、黄酮类化合物合成代谢等抗逆相关通路。通过计算模块内基因的连通性,挖掘出了网络中的核心基因,功能预测表明,这些基因可能在逆境胁迫响应中发挥重要作用。本研究为进一步理解棉花抗黄萎病的分子机制、选育棉花抗病新品种提供了理论指导。     

棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针,利用杂交方法,对优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行筛选。从30 336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆,分别为127K13,128D14,169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切,回收2~4 kb的DNA片段并连接到载体pUC118BamHI-BAP上,构建了含有该基因片段的亚克隆文库,共含有4 224个克隆。经电泳检测,插入片段在1~3 kb,平均为2 kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。     

棉属D基因组3个野生棉种Bet v1基因鉴定及功能分析

【目的】对棉花D基因组中Bet v 1基因家族进行分析,比较其在不同抗性棉种间的表达模式差异,为深入研究Bet v 1基因在棉花抗黄萎病中的作用提供理论依据。【方法】通过生物信息学方法对D基因组中Bet v 1基因进行鉴定。通过雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)、三裂棉(G. trilobum,D8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D1)转录组和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析Bet v 1基因在黄萎病菌处理下的表达模式。利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)对Bet v 1基因进行功能鉴定。【结果】[棉花D基因组中包含59个成员,其中57个基因带有内含子,分布于8条染色体上,多数为亲水性蛋白并定位于细胞质。]黄萎病菌胁迫条件下3个野生棉种的Bet v 1基因表达量与其抗病水平一致。将不同表达水平的基因分为3组,其中第3组基因响应黄萎病菌侵染并在抗病棉种瑟伯氏棉中高表达,表明该组基因可能与黄萎病胁迫应答反应有关。从中筛选出高水平表达的Bet v 1基因,在陆地棉中沉默相应的同源基因,棉株感病加重,揭示该基因在棉花抵御黄萎病菌侵染过程中起正调控作用。【结论】响应黄萎病菌胁迫的Bet v 1基因在棉花抗黄萎病复杂的生物过程中至关重要。本研究结果为棉花Bet v 1家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析棉花Bet v 1基因的功能奠定基础。     

油脂形成期棉花种子全长cDNA文库的构建

 提取海岛棉7124开花后25～35 d胚的总RNA,利用SMART技术,经21轮LD-PCR扩增获得全长双链cDNA,经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,收集500 bp以上的片段与pDNR-Lib载体连接并转化到感受态DH10B细胞,构建了棉花种子全长cDNA文库。所构建的原始文库库容为5×10⁶,文库滴度为1.5×10⁸ cfu·mL^-1。在文库中随机挑取180个克隆进行PCR检测,结果显示,文库中插入片段长度为0.5～2.5 kb,将挑取的180个单克隆进行EST测序,无空载序列,说明文库重组率为100%;序列分析结果表明,其中与油脂形成相关的EST有13条。以上数据说明构建的文库质量较高,为进一步从文库中分离棉花脂肪酸代谢关键基因,提高棉花含油量奠定了基础。     

Comparison and development of EST–SSRs from two 454 sequencing libraries of Gossypium barbadense

EST–SSRs of Gossypium barbadense are mainly developed using traditional Sanger sequencing. However, due to the high cost and low throughput of Sanger sequencing, it is necessary to use high throughput sequencing technology for the development of more ESTs to more effectively analyze the structure and function of this species. In this study, a G. barbadense acc. 3–79 unnormalized fiber cDNA library (219.63 Mb) and a G. barbadense cv. Hai7124 normalized root cDNA library (204.61 Mb) were obtained by 454 sequencing. EST–SSRs were identified from the two libraries, and only 7,255 SSRs were obtained from the unnormalized library, with an average frequency of 1/31.00 kb. In contrast, 16,087 SSRs were obtained from the normalized library, with an average frequency of 1/13.02 kb. The frequencies of dinucleotides and tetranucleotides in the two libraries were very different. Comparing the two libraries, we found that a normalized cDNA library is more efficient for mining SSRs. Integrating the two libraries allowed the development of 1,129 EST–SSR markers, and 311 polymorphic loci were integrated into our interspecific BC₁ genetic linkage map. The mapping results showed that the distribution of EST–SSRs on sub-genomes and chromosomes was uneven; however, the distribution of the mapped G. barbadense EST–SSRs on homologous chromosomes was similar, with the exception of Chr05 versus Chr19 and Chr12 versus Chr26. This study provided new EST–SSR markers that will facilitate studies on cotton genetics and breeding.     

小麦抗白粉病SSH-cDNA文库中差异基因的表达模式

为了解白粉菌诱导下抗白粉病小麦的抗病机制,构建了白粉菌接种初期的抑制性消减杂交cDNA(SSH-cDNA)文库。从中随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列后,得到94条EST,利用NCBI的BLAST在线序列比对工具对GenBank的蛋白质数据库进行同源性比对及功能分类。结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)和抗病与防御(30%)。经文库比较,筛选出与病程相关蛋白基因同源的EST(Z25-1)和与谷胱甘肽硫转移酶同源的EST(Z440-1),GenBank登录号为EX567369和EX567360。以其EST序列为依据设计引物,通过RT-PCR分析它们在白粉菌诱导下的表达模式,结果该2基因表达存在明显差异。其中,Z25-1在未接种白粉菌时具有一定的表达量,白粉菌侵染后表达量开始上升,侵染72 h时表达量最高,然后下降;Z440-1在未接种时也具有一定的表达量,但在接种初期表达微弱,甚至不表达,24 h后表达开始上升,到72 h时达最高,然后下降。本研究表明,病程相关蛋白和谷胱甘肽硫转移酶属于诱导型表达基因,且参与白粉病抗病反应,在白粉菌诱导72 h时表达量最高。     

低温胁迫下东农冬麦1号分蘖节SSH文库的构建及文库中3个基因的表达模式

为揭示高抗寒冬小麦品种东农冬麦1号的抗寒分子机制,在北方寒地自然条件下,于越冬前(5℃)和越冬期(-25℃) 分别对分蘖节取样,利用抑制消减杂交技术构建该品种低温胁迫相关基因的cDNA文库。在cDNA文库中随机挑选300个阳性克隆测序,获得230条高质量的表达序列标签(EST)。对该序列进行BLAST比对及功能注释,发现文库中基因组成类型复杂多样,其中应对胁迫的基因(如热激蛋白、CS66、Wcor8等)以及参与编码60S和40S核糖体亚基的基因出现的频率较高,这些基因可能与东农冬麦1号的安全越冬有密切关系。对文库中筛选到的2种未知基因和Clp基因进行荧光定量PCR分析,发现其表达水平随着温度降低而不同程度升高;在弱抗寒性小麦品种济麦22中,这些基因则有不同的表达模式。推测这些基因在抗低温胁迫过程中发挥重要作用。     

花生栽培种EST-SSRs分布特征及应用研究

利用自行开发的20 160条花生栽培种荚果EST, 通过序列拼接, 获得8 289条无冗余EST。经搜索, 共检测出740个SSR位点, 分布于651条EST中, 发生频率为7.8%, 平均每6.8 kb EST序列含一个SSR位点。功能注释结果表明具生物过程、分子功能和细胞组分的EST分别为73、111和56条。在花生荚果EST-SSR中, 三核苷酸重复类型出现频率最高, 占总SSR的62.8%, 其次是二核苷酸重复类型, 占总SSR的33.6%。在出现的26类重复基序中, AG/TC重复基序出现频率最高, AAG/TTC次之。利用Primer premier 5从651条含有SSR的EST中共设计引物233对, 从中随机选取100对引物检测EST-SSR在花生栽培种中的多态性及在野生种中的可转移性。结果表明, 有86对引物在供试的22个花生栽培品种中得到有效扩增, 其中10对在栽培种中具有多态性, 每对引物检测出的等位基因数2~3个, 平均2.2个。可扩增引物在野生种中的可转移率为12.5%~100%,平均96%。在野生种间检测出多态性的引物76对,每对引物检测出等位基因2~9个, 平均4.06个。     

擎天凤梨花器官全长cDNA文库的构建及EST分析

为了通过基因工程手段来培育花色丰富、花型奇特的擎大凤梨新品种,从擎天凤梨中筛选出花色、花型相关调控基因则是十分必要的.本研究以擎天凤梨属品种Ostara为材料,采用SMART技术成功构建了擎天凤梨花器官的质粒型全长cDNA文库,初始文库滴度为3×10~6,插入片段平均长度大于1 kb;随机挑取2004个阳性克隆进行5'EST测序,获得高质量序列1 758条,经拼接获得1 365条单基因簇(unigene),其中跨叠群(contig)175个和单条序列(singlet)1 195个;经ORF寻找共获得有效ORF 1 283条;经COG分析EST序列编码的蛋白质被分为22类;经Blast分析后,获得一批花色、花器官发育、花期调控以及其它育种价值基因(包括cDNA全长或片段).该研究结果为擎天凤梨的花色、花型转基因等育种奠定了基础.     

棉花6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位

利用棉花纤维cDNA文库, 分离到6个小分子质量的热激蛋白基因。序列结构分析发现, 它们分别属于3种不同类型的小热激蛋白。RT-PCR分析表明, 它们在棉花体内具有不同的转录表达特征, 可能行使不同的功能, 它们的转录与棉花特定的发育阶段相关, 线粒体小热激蛋白和细胞质I类小热激蛋白基因受纤维启始和分化的调控, 而细胞质II类小热激蛋白与棉花叶片的生长发育相关。利用本实验室的四倍体棉花遗传图谱, 对这6个小热激蛋白基因进行定位, 其中3个被定位在A4、D8和A6染色体上。