球孢白僵菌次生代谢产物对南方根结线虫的作用机制初探

为明确球孢白僵菌Beauveria bassiana对南方根结线虫Meloidogyne incognita的作用机理,从线虫的活动频率、呼吸强度、体液渗透压、总糖含量、可溶性蛋白含量以及乙酰胆碱酯酶(AChE)活性几方面测定了球孢白僵菌Snef23菌株次生代谢产物对南方根结线虫2龄幼虫(J2)的影响。结果表明:Snef23次生代谢产物可抑制南方根结线虫J2的活动频率和呼吸作用,降低其乙酰胆碱酯酶活性,增强虫体内容物的渗漏,干扰J2体内糖和可溶性蛋白的代谢,从而达到毒杀致死作用。研究结果为探明球孢白僵菌杀线虫的作用机制提供了理论依据,可为更好地利用球孢白僵菌及其他天然产物防控植物的线虫病害提供参考。     

舞毒蛾DnaJ1基因克隆分析及对甲萘威胁迫响应

Dna J蛋白是Dna K/Hsp70的辅助分子伴侣,通过调节Hsp70的ATPase活性来影响蛋白复合体的合成与组装。为明确舞毒蛾Lymantria dispar的LdDnaJ1基因特性及对杀虫剂甲萘威的胁迫响应,通过克隆LdDnaJ1全长基因并运用实时荧光定量RT-PCR技术测定了甲萘威对其LdDnaJ1基因表达量的影响。结果表明,舞毒蛾Ld Dna J1全长基因开放阅读框为1 062 bp,编码353个氨基酸,分子质量为39.91 kD,理论等电点为5.65;舞毒蛾Dna J与柑橘凤蝶Papilio xuthus Dna J亲缘关系较近。甲萘威对舞毒蛾2龄幼虫24 h和48 h的致死中浓度LC50分别为74.04 mg/L和31.48mg/L。低剂量(LC_5、LC_(10)和LC_(30))甲萘威胁迫下,舞毒蛾2龄幼虫Ld Dna J1基因表达量均下调,LC_(30)甲萘威处理后72 h时LdDnaJ1基因表达量最低,仅为对照的15.70%。表明甲萘威可抑制舞毒蛾LdDnaJ1基因的表达,且呈现明显的时间和剂量效应。     

烟蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析

为探讨UV-B胁迫对烟蚜Myzus persicae热激蛋白Hsp90基因表达量的影响,采用RT-PCR与RACE技术克隆了烟蚜热激蛋白Hsp90基因的全长,并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术研究了烟蚜Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下的表达量变化。结果表明,烟蚜Hsp90基因的cDNA全长为2 670 bp,编码728个氨基酸,编码蛋白质的相对分子量为82.6 kD,等电点为4.95,获得的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的1个签名序列及C末端MEEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。系统进化树结果显示,烟蚜Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同时长UV-B胁迫下烟蚜Hsp90均有表达,随着照射时间延长,Hsp90表达量表现为先上升后下降的趋势;与对照相比,照射时间为15、30、60、90和120 min时,Hsp90表达量均显著升高,且在60 min时Hsp90表达量达最大,是对照组的2.05倍。表明Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下差异表达,在烟蚜适应紫外胁迫的分子机制中具有重要作用。     

绿僵菌与FKBP52联合使用对西花蓟马的毒力

为阐明绿僵菌与昆虫免疫抑制蛋白的增效机理,采用浸渍法测定昆虫免疫抑制蛋白FKBP52与金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae对西花蓟马Frankliniella occidentalis的毒力和其体内羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）、谷胱甘肽-S转移酶（glutathione-S transferase,GST）、酚氧化酶（phenoloxidase,PO）及几丁质酶活性的变化。结果显示,金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用对西花蓟马的致死中时LT₅₀为7.32 d,优于绿僵菌单用（10.87 d）或FKBP52蛋白单用的（14.15 d）。金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用9 d时,西花蓟马的累计死亡率达81.11%,显著高于绿僵菌单用（45.56%）或FKBP52蛋白单用的（36.67%）;金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用的协同毒力指数为24.10,表现为增效作用。金龟子绿僵菌与FKBP52蛋白联合使用1 d后,西花蓟马体内CarE和PO活性小于金龟子绿僵菌单用后的活性;联合使用2 d后,西花蓟马体内几丁质酶活性小于绿僵菌单用后的活性,而CarE和GST活性均大于金龟子绿僵菌单用后的活性;联合使用3 d后,西花蓟马体内几丁质酶、CarE和PO活性均大于绿僵菌单用后的活性。表明与金龟子绿僵菌单用相比,金龟子绿僵菌和FKBP52蛋白联合使用后西花蓟马体内CarE、GST、PO和几丁质酶活性抑制或诱导效应与时间有关,这可能是两者具有增效作用的重要机制。     

Relationships of <Emphasis Type="Italic">Barley yellow dwarf virus</Emphasis>-PAV and <Emphasis Type="Italic">Cereal yellow dwarf virus</Emphasis>-RPV from Iran with viruses of the family <Emphasis Type="Italic">Luteoviridae</Emphasis>

Barley yellow dwarf disease is one of the most important problems confronting cereal production in Iran. Barley yellow dwarf virus-PAV (BYDV-PAV) and Cereal yellow dwarf virus-RPV (CYDV-RPV) are the predominant viruses associated with the disease. One isolate of BYDV-PAV from wheat (PAV-IR) and one isolate of CYDV-RPV from barley (RPV-IR) were selected for molecular characterisations. A genome segment of each isolate was amplified by PCR. The PAV-IR fragment (1264 nt) covered a region containing partial genes for coat protein (CP), read through protein (RTP) and movement protein (MP). PAV-IR showed a high sequence identity to PAV isolates from USA, France and Japan (96–97%). In a phylogenetic analysis it was placed into PAV group I together with PAV isolates from barley and oats. The fragment of RPV-IR (719 nt) contained partial genes for CP, RTP and MP. The sequence information confirmed its identity as CYDV. However, RPV-IR showed 90–91% identity with both RPV and Cereal yellow dwarf virus-RPS (CYDV-RPS). Phylogenetic analyses suggested that it was more closely related to RPS. These data comprise the first attempt to characterise BYD-causing viruses in Iran and southwest Asia. The nucleotide sequence data reported appear in the EMBL, GenBank and DDBJ Nucleotide Sequence Databases under the accession numbers AY450425 and AY450454     

大丽轮枝菌效应蛋白VdSRP2的功能分析

为明确效应蛋白VdSRP2在大丽轮枝菌Verticillium dahliae中的生物学功能,从大丽轮枝菌落叶型菌株V592中克隆VdSRP2基因并进行生物信息学分析,利用酵母转化酶分泌系统对其信号肽活性进行测定,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)技术分析VdSRP2基因在大丽轮枝菌中的表达模式,并以V592菌株为材料获得VdSRP2基因的敲除突变体和过表达体菌株,通过表型分析和致病性测定确定VdSRP2基因的生物学功能。结果显示,VdSRP2基因编码232个氨基酸,含有5个半胱氨酸残基,N-端信号肽具有分泌活性,为真菌的典型效应蛋白;VdSRP2基因主要在大丽轮枝菌菌丝和微菌核中表达,其中经棉花根系诱导培养24 h时表达量最高;与野生型菌株V592相比,VdSRP2基因敲除导致大丽轮枝菌的产孢量和孢子萌发率显著下降,不能形成微菌核,对棉花的致病力明显减弱;但VdSRP2基因敲除不影响大丽轮枝菌的穿透能力;VdSRP2基因在本氏烟和棉花叶片瞬时表达不会诱导细胞死亡。表明VdSRP2是大丽轮枝菌微菌核形成必需...     

小麦矮腥黑粉菌g9890基因编码效应蛋白的生物信息学分析及亚细胞定位

为明确小麦矮腥黑粉菌Tilletia controversa g9890基因编码效应蛋白的生物学功能,根据小麦矮腥黑粉病菌转录组测序结果,筛选出效应蛋白g9890,通过PCR技术获得g9890基因cDNA的全长序列,并对其进行生物信息学以及亚细胞定位分析。多种生物信息学数据库分析表明,g9890基因全长为1 038 bp（包括终止密码子）,共编码345个氨基酸,相对分子质量为37 353.32,理论等电点为5.02。g9890效应蛋白不稳定系数为15.94,疏水性指数为-0.312,是一种亲水性且稳定的蛋白。将g9890基因与pbin-GFP载体重组,利用冻融法转化至根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101中,将其注入烟草进行瞬时表达分析,并通过共聚焦激光显微镜观测该基因的定位状况,结果显示,g9890定位在细胞膜和细胞核上。     

甜菜夜蛾中肠碱性磷酸酶alp2基因的克隆、表达及功能分析

为探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua中肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase protein 2,ALP2)是否为Cry1Ac杀虫蛋白的受体,采用同源克隆和RACE技术克隆了编码alp2基因的完整c DNA序列,利用荧光定量PCR比较了甜菜夜蛾幼虫中肠不同龄期ALP2表达量的差异,利用Ligand blot方法检测了中肠ALP2与Cry1Ac杀虫蛋白的结合。结果表明,alp2基因序列全长1 629 bp(Gen Bank序列号为KP420013),编码542个氨基酸,预测在氨基酸序列N端包含1个由21个氨基酸组成的信号肽,在C端存在1个GPI修饰的锚定位点,且在整个氨基酸序列中存在多个糖基化修饰位点。在整个甜菜夜蛾幼虫期均有ALP2表达,但不同龄期的表达量差异显著,1龄幼虫期表达量最低,4龄幼虫期最高。Ligand blot方法检测结果表明原核表达的ALP2片段与活化的Cry1Ac杀虫蛋白可以结合。研究表明,甜菜夜蛾中肠的ALP2可能是Cry1Ac的受体之一。     

Hpa1 secretion via type III secretion system in <Emphasis Type="Italic">Xanthomonas oryzae</Emphasis> pv. <Emphasis Type="Italic">oryzae</Emphasis>

In many Gram-negative plant pathogenic bacteria the type III secretion system (TTSS), encoded by hrp genes, is essential for pathogenicity in the host and induction of a hypersensitive reaction (HR) in nonhost plants. The expression of hrp genes has been suggested to be repressed in complex media, whereas it is induced in planta and under certain in vitro conditions. We recently reported that XOM2 medium allows efficient hrp expression by Xanthomonas oryzae pv. oryzae. In this study, we investigated hrp-dependent secretion of proteins by the bacteria in vitro. Using modified XOM2, in which bovine serum albumin was added and the pH was lowered to 6.0, we detected at least 10 secreted proteins and identified one as Hpa1. This is the first evidence of protein secretion via TTSS in X. oryzae pv. oryzae.     

沃尔巴克氏体感染对黑腹果蝇头部转录组的影响

为明确沃尔巴克氏体Wolbachia对果蝇神经行为影响的分子机制,采取转录组测序技术对感染沃尔巴克氏体和未感染的黑腹果蝇Drosophila melanogaster头部样本进行转录组测序、组装、注释,筛选感染沃尔巴克氏体wMel和未感染黑腹果蝇头部转录组间的差异表达基因,并选择差异表达基因中差异倍数较大或与神经行为相关的基因进行qPCR验证。结果表明,感染沃尔巴克氏体wMel和未感染黑腹果蝇头部差异表达基因有679个（差异倍数≥2,P<0.05）,其中,由于感染沃尔巴克氏体wMel而上调表达的基因有566个,下调表达的基因有113个。GO功能注释分析显示,差异表达基因与代谢过程、催化和结合功能相关。KEGG通路注释分析发现,差异表达基因主要富集在蛋白消化与吸收、内分泌、神经活性配体-受体互作以及激素合成等通路中。从差异表达基因中筛选出11个基因进行qPCR验证,有9个基因的表达趋势与RNA测序结果一致。表明沃尔巴克氏体可广泛影响果蝇头部基因的表达水平,暗示可能由此影响宿主的神经行为。     

核盘菌自噬相关基因SsATG5和SsATG8的功能分析

为探究自噬在核盘菌Sclerotinia sclerotiorum致病过程中的作用,利用酵母Saccharomyces自噬相关基因（autophagy-related gene,ATG）编码的蛋白序列比对核盘菌基因组,获得核盘菌假定ATG,并以核盘菌1980菌株为出发菌株,基于同源重组的原理对假定ATG进行敲除和回补,并测定不同突变体的生长表型和致病能力。结果表明,从核盘菌基因组中比对到2个ATG,分别命名为SsATG5和SsATG8,两者在核盘菌致病过程中均上调表达。SsATG5和SsATG8敲除突变体在菌丝生长、产草酸和侵染垫形成方面与野生型菌株无明显差异,但SsATG5敲除突变体在离体拟南芥Arabidopsis thaliana叶片上的致病力显著下降了约40%,在活体拟南芥植株上的致病力显著下降了约80%,同时SsATG5回补突变体恢复了正常的致病力。表明SsATG5参与了核盘菌的致病过程,证实自噬在核盘菌致病过程中发挥着重要作用。     

Local and systemic resistance to fungal pathogens triggered by an AVR9-mediated hypersensitive response in tomato and oilseed rape carrying the Cf-9 resistance gene

Tomato and transgenic oilseed rape plants expressing the Cf-9 resistance gene develop a hypersensitive response (HR) after injection of the corresponding Avr9 gene product. It was investigated whether induction of a HR conferred resistance to different fungal pathogens in tomato and oilseed rape. Induction of an AVR9 mediated HR at the pathogen infection site delayed the development of the biotrophs Oidium lycopersicum in tomato and Erysiphe polygoni in oilseed rape, but enhanced the development of the necrotrophs Botrytis cinerea and Alternaria solani in tomato and Sclerotinia sclerotiorum in oilseed rape. Interestingly, delayed fungal disease development was observed in plant tissues surrounding the HR lesion regardless of whether a necrotrophic or biotrophic pathogen was used. In tomato, AVR9 injection induced systemic expression of PR1, PR2 and PR3 defence genes but did not induce systemic resistance to O. lycopersicum, B. cinerea or A. solani. In oilseed rape, AVR9 injection temporarily induced systemic resistance to Leptosphaeria maculans and E. polygoni, but did not induce detectable systemic expression of PR1, PR2 or Cxc750. These results give new insights into the potential uses of an induced HR to engineer disease resistance.     

两种蚜小蜂对烟粉虱MED隐种的田间笼罩控效评价

为明确烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种优势寄生蜂海氏桨角蚜小蜂Eretmocerus hayati ZolnerowichRose与浅黄恩蚜小蜂Encarsia sophia GiraultDodd对其控制效果的影响,在棉田尼龙纱网笼罩中释放烟粉虱之后,再分别单独释放海氏桨角蚜小蜂、浅黄恩蚜小蜂以及二者以不同比例组合(1∶1、1∶3、3∶1)释放,定期调查统计2种蚜小蜂对烟粉虱的寄生量和烟粉虱的种群动态。结果表明,相对于不放蜂对照,自首次放蜂后40 d开始,所有放蜂处理均能显著降低烟粉虱若虫种群密度,每100 cm~2叶片上均少于1.00头,但各处理间的烟粉虱种群密度无显著差异;海氏桨角蚜小蜂和浅黄恩蚜小蜂以3∶1比例组合释放的处理中对烟粉虱的寄生量最高,每100 cm~2棉花叶片上能达到4.25头。表明在棉田中对烟粉虱进行生物防治时,以初级寄生蜂海氏桨角蚜小蜂与复寄生蜂浅黄恩蚜小蜂为3∶1的比例释放,可以到达较好的控制效果。     

Soybean plants expressing an active oligomeric oxalate oxidase from the wheat gf-2.8 (germin) gene are resistant to the oxalate-secreting pathogen Sclerotina sclerotiorum

Sclerotinia stem rot (SSR) caused by Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) De Bary is a serious fungal disease of soybean. Senescing petals provide a starting nutrient source for the invasion of healthy tissue by the advancing oxalic acid secreting fungal hyphae. Since oxalic acid is a major pathogenicity factor of SSR, transgenic soybean capable of degrading oxalic acid may be resistant to the pathogen. Transgenic soybean plants were produced byAgrobacterium -mediated transformation with the wheat germin gene (gf-2.8) encoding an oligomeric protein, oxalate oxidase (OxO), which oxidizes oxalic acid to carbon dioxide and hydrogen peroxide (H₂O₂). Transgenic soybean homozygous for 35S- gf-2.8 produced an approx. 130 kDa protein indistinguishable from wheat germin, and with OxO activity. OxO activity was prominent in cell walls proximal to the site of pathogen attack. The transgenics had greatly reduced disease progression and lesion length following cotyledon and stem inoculation with S. sclerotiorum indicating that the germin gene product conferred resistance to SSR. This is the first report of plant resistance to the fungal pathogen S. sclerotiorum in transgenic plants expressing OxO.     

采用饲喂法和微注射法评价Cry2Aa蛋白对二化螟盘绒茧蜂的安全性

为评价转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂Cotesia chilonis的安全性,采用饲喂法和微注射法综合评价转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂的影响。结果表明,寄生饲喂转Cry2Aa基因水稻T2A-1的二化螟Chilo suppressalis后,二化螟盘绒茧蜂体内未检出Cry2Aa蛋白,其每茧块茧数、茧长、雄成虫寿命和雌雄比分别为20.00个、2.58 mm、2.34 d和3.10,均显著小于对照,而卵及幼虫的总历期、蛹期、雌成虫寿命、茧质量和成虫质量均与对照差异不显著;寄生微注射Cry2Aa蛋白的二化螟后,除卵及幼虫的总历期和蛹期外,二化螟盘绒茧蜂其他生命表参数和体内过氧化物酶（peroxidase,POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase,GR）活力均与阳性对照之间差异显著;寄生微注射Cry2Aa蛋白的二化螟后,二化螟盘绒茧蜂所有生命表参数及体内POD、SOD和GR活力均与阴性对照之间无显著差异。表明饲喂法中转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂产生的影响是由寄主介导效应引起的,而非Cry2Aa蛋白本身,因此转Cry2Aa基因水稻T2A-1对二化螟盘绒茧蜂安全。     

对大黑鳃金龟甲幼虫高效的苏云金芽胞杆菌筛选及cry基因鉴定

为获得对大黑鳃金龟甲幼虫具有较高杀虫活性的菌株,利用拌土法测定了本实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)对大黑鳃金龟甲的杀虫活性,建立Bt菌株比较鉴别技术来进行多样性分析,并对菌株的晶体形态及幼虫感染Bt后的中肠组织切片进行观察。结果显示,从500株Bt菌株中筛选到42株对大黑鳃金龟甲幼虫具有不同程度活性的菌株,分属于14个菌株类型;其中有10株校正死亡率大于60%,261-1菌株杀虫活性最高,7 d校正死亡率达100%。从14个菌株类型中各选取1个代表菌株进行基因鉴定,仅P65-1、1126-1、FCD114和78-2菌株分别含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea共5个cry8类新基因,其它10个菌株均不含cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。14个菌株中,78-3、127-2和1198-1菌株能产生双锥体型晶体,261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和1126-1菌株能产生球形晶体。幼虫感染261-1、1198-1、FCD114、1126-1、QDL40-2菌株后,中肠组织发生明显的病理变化:2 d时肠壁细胞明显出现空洞化,排列疏松,4 d时受到严重破坏并脱离底膜。表明筛选到的Bt菌株具有防治大黑鳃金龟甲幼虫的潜力。     

枯草芽胞杆菌与氟环唑联用对禾谷镰孢霉的增效作用机制

为验证枯草芽胞杆菌与氟环唑联用对禾谷镰孢霉的增效作用,用平板倒扣法和固体平板扩散法—打孔法测定菌药联用后枯草芽胞杆菌挥发性物质、抗真菌蛋白对禾谷镰孢霉的抑菌活性,观察抗真菌蛋白对禾谷镰孢霉菌丝形态的影响,并用刚果红染色法测定菌药联用后枯草芽胞杆菌纤维素酶活性。结果表明:菌药联用对禾谷镰孢霉的最高抑菌活性可达74.44%,表现增效和持效作用;枯草芽胞杆菌挥发性物质和抗真菌蛋白分别与氟环唑联用均可增强禾谷镰孢霉抑菌活性;菌药联用后枯草芽胞杆菌纤维素酶活性提高。研究表明枯草芽胞杆菌与氟环唑联用的增效机制是增强枯草芽胞杆菌挥发性物质对禾谷镰孢霉的抑菌活性,抗真菌蛋白活性的提高加强了禾谷镰孢霉菌丝溶解的程度,纤维素酶活性的增强提高了禾谷镰孢霉空间竞争作用和生物防治潜能。     

棉铃虫BR-C Z2基因的克隆、原核表达及其表达谱

为明确转录因子广泛锌指复合物（broad complex,BR-C）在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育过程中的作用,基于转录组序列从棉铃虫幼虫中肠克隆获得BR-C Z2的cDNA序列并对其氨基酸序列和蛋白结构进行生物信息学分析,利用原核表达系统表达其融合蛋白;用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）技术分析BR-C Z2基因在棉铃虫体内的表达规律,以及2-十三烷酮（2-tridecanone,2-TD）处理后其在棉铃虫6龄幼虫中肠内的变化规律。结果显示,棉铃虫BR-C Z2基因的开放阅读框为1 257 bp,编码418个氨基酸,预测编码蛋白的分子量和理论等电点分别为46.63 kD和6.94,主要定位于细胞核中。系统进化树结果显示棉铃虫BR-C Z2与家蚕Bombyx mori的BR-C Z2亲缘关系最近。成功表达His-HaBR-C Z2融合蛋白。BR-C Z2基因在棉铃虫蛹期和6龄幼虫中肠组织中相对表达量最高;不同浓度2-TD处理后,棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量变化趋势不同,其中15 mg/g浓度处理12 h后棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量达到峰值,是对照的2.5倍,而20 mg/g浓度处理20 h后棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量降到最低,为对照的45.13%。表明BR-C Z2基因可能参与棉铃虫的生长发育,并响应2-TD的胁迫。