转基因小鼠生产过程的优化

摘要： 以昆明小鼠作为制备转基因小鼠的供、受体，优化了转基因小鼠生产过程中的显微注射和移植过程，调整了对大小不同的DNA的注射浓度和受体鼠的选择标准。结果使转基因效率从10%上升到20%以上; 并得出DNA的大小与注射浓度的最适结合点为大于10 kb的DNA, 浓度应控制在2~3 μg/mL。     

原核注射制备转基因小鼠的技术优化

原核注射技术已经是目前制备转基因小鼠(Mus musculus)最有效的手段,但不同实验室所报道的转基因效率差异较大,效率不高仍是该技术的主要缺点.为提高转基因小鼠的制备效率,本研究对转基因小鼠制备过程中的原核注射的多个方面都进行了改进,尤其是在注射针直径、外源基因浓度、单/双原核注射以及胚胎移植等主要步骤上的进行了优化.实验结果表明,不同浓度的外源基因对转基因小鼠的阳性率有很大影响.外源基因为1.00、2.50、3.00和4.00 μg/mL浓度时,转基因小鼠阳性率分别0.67％、14.9％、30.6％和21.4％.其中,外源基因浓度在3.00 μg/mL极显著高于其他各组(P＜0.01).采用阳性率最高的3.00 μg/mL浓度又进行了单双/原核注射比较,发现转基因阳性率在进行双原核注射组显著高于单原核注射组(24.3％ vs.18.3％,P＜0.01).将显微注射后的2细胞时期胚胎经输卵管移植到0.5、1.5和2.5d假孕母鼠体内,产仔率分别为68.6％、67.6％和40.1％,转基因阳性率为17.4％、22.5％和10.1％.比较发现,0.5 d与1.5d代孕母鼠产仔率没有差异,但1.5d代孕组转基因阳性率(22.5％)显著高于其他组.结果表明,采用尽可能细的注射针、2～4 μg/mL的DNA载体浓度、双原核注射、1.5d的假孕母鼠和正确的胚胎移植操作,是获得高效率转基因小鼠的关键.本研究对从事动物转基因技术研究的实验室提供一些有益的借鉴.     

人肥胖基因(Obese)转基因小鼠动物模型的建立

用三个含有兔乳清酸性蛋白基因(rWAP)启动子,人ob基因(cDNA)及rWAP基因终止子的质粒经亚克隆构建了融合表达载体.用NotI消化表达载体,回收包含上述三个表达元件且插入方向正确的片段(约7.5 kb)并进行显微注射.注射用的DNA浓度为2 g/mL,每mL注射液中DNA的拷贝数约为2.4??011 ,每一枚原核期小鼠胚胎注射1～2 pL.采用标准的显微注射方法,获得48只后代小鼠.四周龄时剪尾并提取尾组织DNA,以人ob基因cDNA为探针,用EcoRI消化总组织DNA,经Southern杂交确证其中两只母鼠为转人ob基因小鼠.在出生的后代小鼠中,转基因阳性率约为4 %(2/48).     

ICSI介导生产转基因牛胚胎影响因素的研究

采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射（ICSI）介导转基因效果的影响。结果表明：线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组（19.8%,16.7%VS 7.9%,p〈0.05）。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率（24.7%）最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组（41%VS 20.5%,p〈0.01）;当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异（p〉0.05）,但二者之间胚胎的基因表达率差异显著（46.83%VS 28.57%,p〈0.05）。以上结果表明：（1）牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;（2）精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;（3）25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。     

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)转基因小鼠的建立

利用小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的调控序列指导人Ｇ－ＣＳＦ基因所构建的融合基因,注射小鼠受精卵,ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,获得了人Ｇ－ＣＳＦ转基因小鼠,整合率为２．３７％,这一模型的建立为转基因大动物生产提供了资料和方法。     

皮肤特异表达c-Myc转基因小鼠的建立与分析

以CMV-PAAV载体为基础载体,以皮肤特异人K14（人角蛋白14）基因启动子替换原质粒中的CMV启动子后,在其多克隆位点区依次插入鼠c-Myc基因的cDNA序列和gfp基因的编码序列,构建了高效表达c-Myc基因的真核表达载体。通过双原核显微注射技术,将线性化的载体DNA注入到C57BL/6小鼠受精卵的两个原核中,然后将注射后状态良好的胚胎移植到代孕鼠的输卵管中,共移植了256枚受精卵,6只受体怀孕,最终获得44只成年小鼠。通过PCR和Southern blot分析证明2只为阳性转基因小鼠,转基因阳性率为4%。Southern杂交结果分析显示外源片断是以多拷贝串联重复的形式整合到鼠染色体中     

转CBF1基因烟草植株的花器官变异及其插入区侧翼序列的分析

在转CBF1基因烟草的后代中发现了花器官变异的植株，主要有花瓣裂瓣、花型变小、花丝变短花粉萌发率降低和育性降低等表型变化。采用TAIL－PCR方法，从花器官变异明显和不明显的植株中分别克隆到了各自的T－DNA插入区域的侧翼序列。将这些侧翼序列与GenBank database及pBI121质粒进行比对。结果表明表型差异明显的2个植株的T－DNA插入位点相同，属于一个转基因株系；且T－DNA插入区位于烟草基因组的非编码区。说明这些花型的变异并非由T－DNA在受体基因组中插入位点不同造成的，也不是由外源转基因对受体功能基因的破坏引起的。     

转基因水稻DNA样品浓度以及存放条件对PCR定性检测的影响

通过在不同模板DNA浓度(0.2～16 ng/μL)、不同转基因含量(0.05%～50%W/W)以及不同模板存放温度(22℃、4℃和-20℃)和存放时间(1、2、3周和1,3个月)条件下进行转基因水稻外源成分的定性PCR检测,发现当模板浓度在0.4 ng/μL以上时所有引物均能扩增出目标片段,对于转基因含量为1.0%和0.1%的混合样品,能稳定检测出转基因成分所需的DNA最低浓度分别为1和2～4 ng/μL.模板DNA的不同温度存放条件对检测没有明显影响,长时间存放后PCR扩增产物条带亮度有所减弱.     

一种适于转基因番茄检测的高效稳定的DNA提取方法

本研究介绍了一种稳定而高效的番茄DNA提取方法。该方法所提取的DNA不但纯度高，而且浓度大，产率达到0.23%，简便易得。可用于对转基因番茄进行稳定而准确的PCR检测。     

用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready及其深加工食品*

用从转基因大豆(Glycine max)颗粒中提取的DNA作为模板,经过稀释,形成不同浓度梯度的DNA溶液,然后用巢式和半巢式PCR进行扩增反应。结果表明,巢式和半巢式PCR均可以扩增DNA浓度为10^14g/μL的溶液。用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测,可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(housekeeping gene)。其中,2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因CaMV35S-CTP4基因片段,说明这些食品中含有转基因大豆成分,占被检测食品的76．5％。用巢式PCR和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready和其深加工食品是一种有效的方法。