苏云金芽胞杆菌转座子整合载体的构建

利用苏云金芽胞杆菌转座子Ｔｎ４４３０的转座机制构建了可用于将外源基因整合到染色体的整合载体系列。将Ｔｎ４４３０的解离酶基因（ｔｎｐＩ）和转座酶基因（ｔｎｐＡ）移至两个倒转重复的反向重复序列之外,并用多克隆位点取代;将这种转移结构置入不稳定的穿梭载体ｐＢＭＢ６２２Ｎ中,获得ｐＢＭＢ－Ｆ７和ｐＢＭＢ－Ｒ１４。当红霉素抗性基因插入其中的多克隆位点后,在ＢＭＢ１７１ ｔｎｐＡ基因会随着质粒的消除而消失。     

苏云金芽胞杆菌WZ-9菌株对马铃薯瓢虫的毒力及其杀虫基因的研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillus tbutingiensis)WZ-9是从土壤中分离的对马铃薯瓢虫(Henosepilachna vigintioctomaculata)的幼虫有特异杀虫活性的新菌株.实验对WZ-9菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等进行了研究.结果表明,WZ-9菌株可产生菱形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130 Kd;液体培养的生长周期是24 h,随菌株的生长培养基Ph发生较大波动,在潜伏期和稳定期,Ph变化较小,在对数生长期Ph呈先迅速下降、再缓慢回升的变化趋势;生物活性测定表明,WZ-9菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72 h校正死亡率达100%,LC50为2.95×107细胞/Ml;基因型鉴定表明,WZ-9菌株含有cry7基因,利用PCR扩增方法获得了1条总长为3 781 bp基因序列,其中包含了1个3 414 bp开放读码框,其编码蛋白由1138个氨基酸残基组成,与Cry7Ab2具有99.65%序列同源性,存在4个氨基酸差异,亲缘关系最近,被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3(登录号为BI1015188).     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry218的克隆和表达

从对棉铃虫高毒力的苏云金芽胞杆菌２１８菌株中克隆到杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙ２１８，限制性内切酶图谱表明该基因属于ｃｒｙ１Ａｃ基因。改造了两个质粒载体，并以此将ｃｒｙ２１８基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３和苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Ｂｔｉ７８／１１中，重组菌均表达１３０ｋＤ蛋白质，对小菜蛾的杀虫率在稀释１０００倍和３０００倍时可分别达到９０％以上和８０％以上。     

在大肠杆蓖TG1中克隆和表达苏云金芽胞杆菌cryI基因

本研究分离并提纯苏云金芽胞杆菌８０１０菌株的质粒ＤＮＡ，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶解后与ＤＩＧ标记的ｃｒｙＩ基因ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段的ＲＮＡ探针杂交，显示出分子量分别为６．５６ｋｂ和４．４ｋｂ的阳性片段。用Ｂｌａｓｓｍｉｌｋ回收４．４ｋｂ的阳性片段并与双功能载体ｐＲＩＴ５重组，转化感受态大肠杆菌ＴＧ１细胞，通过斑点杂交和快检获得含４．４ｋｂ片段的克隆株Ｔ２，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明它表达了１３０ｋＤ     

利用苏云金芽胞杆菌非芽胞特异性的启动子表达cry1Ac10和cry1C基因

利用重叠延伸ＰＣＲ技术,将苏云金芽胞特异性的ｃｒｙ３Ａ基因的启动子替换ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因的启动子序列,并用ｃｒｙ１Ａｃ１０基因的终止序列,替换ｃｒｙ１Ｃ基因终止密友子下淳的序列,得到改造的ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因,改免与其内源杀虫晶体蛋白基因竞争转录因子（σ因子）从而提高杀虫晶体蛋白的表达量,为构建高效杀虫工程菌提供了有效的基因。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry7Ba1溶解性改良

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry7Ba1需要在强碱性缓冲液中(pH12.5)才能溶解,而且只有溶解后才能表现出毒力。分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的C-半段替换Cry7Ba1的C-半段,结果发现当Cry7Ba1的C-半段被替换后,重组晶体蛋白与Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下(pH9.5)能有效溶解,而且其杀虫活性没有发生明显变化。本研究结果表明Cry7Ba1晶体蛋白难溶的特性是由其C-半段结构决定的,通过改变其C-半段结构改善溶解性,为该晶体蛋白的应用提供了可能。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry7Ba1溶解性分子改良

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫晶体蛋白Cry7Ba1需要在强碱性缓冲液中（pH12.5）才能溶解,而且只有溶解后才能对小菜蛾（Plutella xvlostella）表现出毒力,其LC50为1.33μg/mL。分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的C-半段替换Cry7Ba1的C-半段,结果发现当Cry7Ba1的C-半段被替换后,重组晶体蛋白与Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下（pH9.5）能有效溶解,而且重组晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性没有发生明显变化,其LC50分别为1.32和1.39μg/mL。结果还显示重组晶体蛋白不需要经过体外溶解就能对小菜蛾表现出杀虫活性。研究结果揭示Cry7Ba1晶体蛋白难溶的特性是由其C-半段结构决定的,通过改变其C-半段结构改善溶解性,为该晶体蛋白在害虫生物防治中的应用提供了可能。     

苏云金芽胞杆菌新型vip3Aa基因的克隆、表达与活性分析

为了发掘新型vip3基因,本研究采用PCR和高分辨熔解曲线的方法对72株菌株中vip3基因进行了鉴定和分析,结果表明,有18株菌呈阳性,分别含有vip3Aa、vip3Af和vip3Ba共3类vip3基因。根据已知vip3基因的全长序列设计引物,以菌株T03B001(B.thuringiensis subsp.sumiyoshiensis)的总DNA为模板扩增出长为2.37kb的全长基因,插入表达载体pEB,转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)菌株,在低温条件下经IPTG诱导后,表达88kD的蛋白,该蛋白由789个氨基酸组成,与已知的Vip3Aa氨基酸一致性为96%,已被国际Bt命名委员会正式命名为Vip3Aa39,GenBank登录号为HMI17631。Vip3Aa39蛋白与本实验室此前获得的Vip3Aa11蛋白进行比较,发现两者存在39个氨基酸的差异。两种蛋白的表达产物采用饲喂法分别对小地老虎(Agrotis ipsilon)、小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua...     

植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用

以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。     

苏云金芽孢杆菌高效杀蚊菌株BRC-ZLL13的鉴定

苏云金芽孢杆菌BRC-ZLL13是一株从白玉兰叶片中分离的高效杀蚊菌株。它对埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊的毒力均高于国际标准菌株以色列亚种IPS82,其生长速度也明显快于后者。本实验对该菌株毒力、血清型、生理生化反应、药敏实验、质粒、杀蚊基因和晶体蛋白等方面的生物学特性进行了研究。结果显示,BRC-ZLL13与对照菌株IPS82同属于以色列亚种,均含有cyt1、cyt2、cry4A、cry4B、cry10和cry11等杀蚊基因,二者在生理生化反应、药敏实验和晶体蛋白图谱等生物学特性上也表现出极高的相似性。另一方面,前者比后者少2条质粒带,这可能是导致BRC-ZLL13生长速度较快的主要原因。综上所述,笔者认为该菌株在公共卫生和生物防治领域具有开发和应用潜力。     

苏云金芽孢杆菌对新秀丽小杆线虫的作用

新秀丽小杆线虫是一种模式生物，能够在室内培养。本研究采用大肠杆菌饲养，获得大量虫源，通过观察该线虫对不同Bt菌株产生毒力反应的情况，筛选含有毒力的Bt菌株。经筛选获得6个菌株的伴孢晶体对新秀丽小杆线虫进行毒性比较，野生菌株Bt-010杀虫快速而持久，毒力强，作用时间大约在36h左右，测得其理想的LC50为0.498µg/ ml。初步纯化其毒性蛋白，发现其主要作用成分是大小为25 – 35 kD的蛋白。DNA Ladder检测发现在这个毒性蛋白不象化学农药一样对线虫的DNA造成损伤。     

鉴别苏云金芽孢杆菌生产菌株MZ1的溶原性噬菌体

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thurillgicnsis，Bt）作为不污染环境而又高效的生物杀虫剂已广泛地应用。可是，在83％的Bt菌株中都能分离到相应的溶原性噬菌体，在发酵生产中由其引起的发酵倒罐率轻者为15％-30％，重者达到50％-80％，甚至会导致工业的破产，因此溶原性噬菌体已成为发酵工业的一大危害。本研究采用溶原性噬菌体的指示菌、直接电镜观察法和噬菌体DNA等综合进行检测，证明了该菌株属于溶原菌。此研究既能为生产上防治溶原性噬菌体提供理论依据，又能为后续阶段研究其溶原性爆发规律及其分子生物学准备了生物实验材料。     

苏云金芽孢杆菌基因组研究概况

迄今为止,全球已有2个Bt株菌株完成了全基因组测序,1个Bt菌株正在拼接中,15个Bt菌株正在进行测序中。已有22个晚质粒完成了全序列测定。助是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株,也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一直是科学家研究的热点,并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。     

以沼渣为原料固态发酵生产Bt生物农药

沼渣是沼气工程中产生的副产物,由于其富含营养物质及微量元素,而广泛应用于农业,畜牧业,养殖业等方面。Bt生物农药是一类具有选择性和高效性的杀虫剂,但是由于其原料的成本较高从而限制了生物农药的发展,而沼渣中富含微生物所需要的各种养分并且价格低廉,因此该文以生产沼气后的沼渣为资源,运用固态发酵,探索了利用沼渣制备苏云金杆菌生物农药的可行性。首先对沼渣营养成分进行了分析,分析表明其营养物质丰富,适合苏云金芽孢杆菌的生长与增殖。其次对菌种的沼渣培养基进行了优化,优化后的培养基质量分数为：50%的沼渣添加35%啤酒糟,10%玉米粉,5%豆饼粉,并与常规培养基和单纯沼渣的发酵进程进行了对比。在优化培养基条件下,发酵48 h后,芽孢数达到5.23×1010 CFU/g,毒力效价为16 100 IU/mg。在传统培养基中芽孢数2.55×1010 CFU/g,毒力效价12 500 IU/mg,而在单纯沼渣中Bt产量及毒性为1.74×108 CFU/g,6000 IU/mg。采用沼渣发酵制备Bt生物农药与传统培养基比较,降低了36.3%的生产成本,且发酵性能优良,也为沼渣的利用寻找到崭新的途径。     

基因工程菌诱导表达苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的条件优化

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,Vip)是在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)营养生长至对数中期到稳定期期间产生的一类蛋白。为获得苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的高效表达条件,本研究利用正交试验综合考察了大肠杆菌(Escherichia coli)重组基因工程菌BL21-p Czn1-Vip诱导过程中诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对Vip3Aa蛋白表达量的影响。结果表明,该工程菌目的蛋白的最优诱导表达条件:诱导温度21℃、诱导时间8 h、诱导剂(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG))浓度为200μg/m L;直观分析表明,影响目的蛋白表达量的最主要因素为诱导温度,其次为诱导时间,诱导剂浓度影响最小;方差分析结果表明,诱导温度的P值0.01、诱导时间的P值0.05、诱导剂浓度的P值0.05,与直观分析结果相一致;利用优化后诱导表达条件进行培养,测得目的蛋白最高表达量可占总蛋白的27.6%,相当于常规诱导方法的2.3倍。本研究为大量制备高纯度Vip3Aa蛋白及其深入的理论研究和实践应用提供了基础资料。     

苏云金芽孢杆菌4.0718菌株晶体毒素性质的研究

以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）4．0718菌株伴孢晶体65kD原毒素为材料，比较了几种染色-脱色方法对电洗脱回收蛋白的影响。蛋白纯化的步骤包括SDS-PAGE分离、采用自制蛋白回收装置电洗脱回收杀虫晶体蛋白及抗胰蛋白酶核心多肽、超滤法脱盐、冷丙酮沉淀法除去考马斯亮蓝及SDS。经SDS—PAGE检测，呈现出均一的蛋白带，回收蛋白达到了电泳纯。以双向凝胶电泳（2-DE）技术分析了苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD—1和4．0718菌株伴孢晶体内的蛋白质组分。结果表明，两者相互匹配的蛋白点有54个，HD—1菌株的130kD亚基有2个点，其等电点在5．25～5．75之间，65kD亚基在等电点3．4～8．3之间具有广泛的分布，130与65kD之间的亚基的等电点集中在3．5～4．2之间，65kD以下亚基的等电点集中在3．5～6．2之间；4．0718菌株的130kD亚基仅有1个点，65kD亚基的蛋白点比HD-1菌株更多，130与65kD之间的亚基、65kD以下的亚基蛋白点均比HD-1菌株多且等电点分布范围更广。     

电子舌预测不同体积分数牛奶的表观黏度

该文为建立牛奶的电子舌响应信号与其表观黏度的关系,在单因素方差分析和主成分分析的基础上,提出了比较多元线性回归、逐步多元线性回归和偏最小二乘回归3种模型对牛奶表观黏度的预测效果的方法。结果显示,单因素方差分析表明体积分数对牛奶的表观黏度和各个传感器响应信号都具有极显著性的影响;主成分分析（PCA）可以用来区分牛奶的5种不同体积分数;偏最小二乘回归模型预测效果最好,模型预测值与实际值的相关系数R达到0.9659,平均相对误差（MRE）和预测均方根误差（RMSEP）分别为4.5499%和8.4645×10-5,建模最佳主成分数为3。研究结果表明,偏最小二乘回归模型是电子舌预测牛奶表观黏度的有效方法,该方法为牛奶表观黏度的科学研究提供参考。     

苏云金芽胞杆菌类ABC transporter基因zwa-FEG能提高双效菌素的抗性

双效菌素(zwittermicin A,ZwA)是一种氨基多元醇类新型广谱抗生素,zmaR为其抗性基因。在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520菌株ZwA合成基因簇末端存在一个类似ABC transporter的序列(命名为zwa-FEG)。将zwa-FEG基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,大肠杆菌能获得ZwA的抗性;将zwa-FEG转移到产ZwA的蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)菌株UW85中,能使其ZwA产量显著提高。推测zwa-FEG是一种ZwA专一性的ABC transporter,它能将ZwA分泌到胞外,从而增强ZwA的合成和ZwA的抗性。