甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

ATP柠檬酸裂解酶(ACL)为细胞质中乙酰辅酶A合成途径的关键调控酶,在生物体正常生长发育中扮演着重要角色。本研究通过Race和电子克隆技术获得编码甘蔗ACL蛋白2个亚基的基因SoACLA-1和SoACLB-1,其编码框长度分别为1 272 bp和1 827 bp,编码423个和608个氨基酸,推测的氨基酸序列与其他物种具有高度相似性,都优先与禾本科植物聚于同一进化分支。2个基因在ATP-grasp功能域、柠檬酸结合位点、组氨酸磷酸化位点和ATP结合、CoA结合、磷酸化区域等,序列高度保守。实时荧光定量PCR结果表明,2个基因均受外源ABA、水分胁迫、水分胁迫加ABA处理诱导表达,且叶中表达量显著高于根系,其中又以水分胁迫处理下的表达量最高,2个基因表现出协同表达模式。SoACLA-1和SoACLB-1的表达与ABA、ROS含量具有相关性,说明它们可能参与了ABA调控的植物对逆境胁迫反应的代谢过程。     

薰衣草芳樟醇合酶基因的克隆、表达及酶活性检测

从高油薰衣草品种“杂花”中克隆得到芳樟醇合酶基因LIS1和LIS2,并对其进行了生物信息学和表达模式分析、原核表达和酶活性检测,以低油品种“法国蓝”为对照。结果表明,LIS1基因编码602个氨基酸,LIS2基因编码564个氨基酸。LIS1蛋白与阔叶薰衣草、一串红的芳樟醇合酶亲缘关系相近,LIS2蛋白与狭叶薰衣草、杂薰衣草的芳樟醇合酶亲缘关系相近。LIS1基因在“杂花”花器官半开期、盛开期和衰败期的表达量均高于“法国蓝”;LIS1基因在“杂花”花萼中的表达量最高,且仅在“法国蓝”雄蕊中少量表达。LIS2基因在“杂花”花器官不同组织和不同发育时期表达量均低于其在“法国蓝”中表达量,该基因在“杂花”花器官衰败期和“法国蓝”花器官半开期表达量最高,在2个品种花萼中高表达。LIS2基因在2个品种不同发育时期及组织中的表达量均明显高于LIS1基因。LIS1和LIS2重组蛋白具有单萜合酶活性,且均参与合成芳樟醇。     

白木香倍半萜合酶基因AsVS的克隆与表达分析

法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)是植物萜类化合物合成途径的重要前体之一,经不同的酶催化可形成各类萜类化合物,Vetispiradiene合酶可催化FPP形成Solavetivone和Lubimin的前体Vetispiradiene。本研究利用白木香转录组数据,首次克隆了编码白木香Vetispiradiene合酶的基因(命名为As VS, Genbank登录号为MH378283),AsVS基因序列全长为1 632 bp,编码543个氨基酸,该氨基酸序列与马来沉香倍半萜合酶聚类于同一分支,具有较近的亲缘关系,该蛋白植物倍半萜的保守性结构域DDXXD,NST/DTE和R(R)X8W,相对分子量为62.73 kD,理论等电点为5.51,包含40个磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;不含跨膜结构域。RT-qPCR分析结果表明AsVS基因在结香剂处理过程中于白木香茎干样品中持续上调表达,其第6天及第9天的表达量分别为对照处理的2.36和5.02倍。此结果为进一步研究As VS基因在白木香萜类化合物的合成及沉香致香成分富集中的功能提供了理论基础。     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

越南油茶环阿屯醇合酶基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆的方法克隆得到环阿屯醇合酶基因全长并命名为CvCAS,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvCAS全长2 411 bp,包括一个2 277 bp完整的开放阅读框,编码758个氨基酸,与茶(Camellia sinensis)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis var. chinensis),刺楸(Kalopanax septemlobus)和人参(Panax ginseng)的CAS蛋白序列相似度均在85%以上,系统发育树分析显示CvCAS与茶(Camellia sinensis)和向日葵(Helianthus annuus)的CAS蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为86.6 kD,理论等电点为6.20,无跨膜螺旋区,属于不稳定亲水性蛋白。序列比对分析表明,CvCAS具有氧化鲨烯环化酶(OSCs)超家族典型结构位点(DCTAE),三萜合成酶高度保守结构...     

甘蓝型油菜蔗糖磷酸合酶(SPS)基因家族成员鉴定及表达分析

蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase, SPS)是调控植物蔗糖合成的限速酶, 对光合产物的转运和积累有重要影响。利用拟南芥SPS蛋白保守结构域在甘蓝型油菜基因组数据库鉴定出11个甘蓝型油菜SPS基因家族成员, 根据系统进化分析将其分成A、B和C共3个亚家族。基因结构预测表明, SPSC-1有5个外显子, 其他SPS基因均有11~15个外显子。顺式作用元件分析表明, 油菜SPS基因除含基本的启动子保守元件外, 还含有许多与逆境和激素响应相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明, BnSPSA1在花中表达量最高, BnSPSA2在各组织中均有不同程度的表达, BnSPSB只在叶、蕾和花中表达, BnSPSC在叶中表达量最高, 在蕾和花中有少量表达而在其他组织中基本不表达, 说明SPS基因在甘蓝型油菜中的表达具有明显的组织特异性; BnSPSA1和BnSPSC在高生物产量油菜叶片中的表达高于低生物产量油菜, BnSPSB则在低生物产量油菜中的表达量更高, 说明SPS基因与油菜生物产量密切相关。本研究为油菜SPS基因的功能研究和利用奠定了基础。     

燕麦葡聚糖合酶基因AsCSLH的克隆及特征分析

β-葡聚糖是燕麦发挥保健作用的重要功能因子,分离其合成关键基因有助于解析燕麦β-葡聚糖积累的分子机制。以高β-葡聚糖燕麦地方品种夏莜麦为材料, 通过RACE和染色体步移的方法克隆了燕麦β-葡聚糖合酶基因AsCSLH及其基因组序列并分析其序列结构特征,采用半定量RT-PCR方法研究该基因组织表达特性。分离出的燕麦CSLH基因包含6个内含子, 内含子剪接方式均符合GT/AG剪接规则,编码区全长2 277 bp,在序列上与水稻CSLH基因的编码区序列相似性最高并且所预测的编码蛋白含有相关多糖合成酶保守结构域。AsCSLH基因在燕麦各组织中均有表达,在灌浆期籽粒中表达水平最高。推测AsCSLH基因在燕麦籽粒的β-葡聚糖合成中起重要作用。     

白菜型油菜WUS基因的克隆与表达分析

WUS基因在植物生长点(shoot apical meristem, SAM)调控方面具有重要作用,本研究选择抗寒性强弱不同且生长点高低不同的白菜型冬油菜(Brassica rapa L.)为材料,采用RT-PCR技术克隆WUS基因并进行了表达分析,并对其功能结构域、系统进化和表达特性进行分析。结果表明,在‘陇油7号’中,WUS蛋白编码310个氨基酸,预测分子质量为23.077 kD,等电点5.58,是一个主要由无规则卷曲与延伸链组成的亲水性蛋白。荧光定量PCR分析表明,相同温度处理下,WUS基因在抗寒性较强、生长点凹陷的白菜型冬油菜中相对表达量高于抗寒性较弱、生长点凸起的白菜型冬油菜,低温(0℃, 4℃和-4℃)处理72 h后,白菜型冬油菜生长点中WUS基因在0℃均上调表达,当温度为0℃时表达量达最大,‘陇油7号’和‘天油2号’较常温上调最为显著,分别上调315.24%、287.56%。与0℃相比较,当温度降为-4℃时,各品种基因的相对表达量显著下调表达,表明WUS基因可能参与抗寒应答及白菜型冬油菜生长点对低温胁迫的响应。     

甜橙柠檬酸合酶基因的克隆及其在果实发育过程中的表达分析

柠檬酸合酶与柠檬酸的积累密切相关,通过分析其与酸含量的关系,为研究该基因的调控机制奠定理论基础。设计特异性引物对柠檬酸合酶基因进行克隆,并采用半定量PCR法对哈姆林叶片、果肉和果皮中该基因的表达模式进行检测。克隆得到柠檬酸合酶基因的cDNA序列,全长1535bp,ORF区含471个氨基酸残基,序列比对显示,哈姆林甜橙柠檬酸合酶基因与其他植物的该基因高度同源。半定量PCR结果显示果肉和果皮中柠檬酸合酶基因在各个时期的表达基本没有变化,而叶片中其表达水平随果实发育成熟不断降低,与果实中柠檬酸含量变化趋势相同。说明叶片中柠檬酸合酶基因表达与果实酸含量正相关。     

施氮量对油菜氮素积累和运转及氮素利用率的影响

于2010-2012年度以5个不同油含量的常规油菜品种为材料,设置120 (N1)、240 (N2)和360 kg hm^–2 (N3) 3个水平的氮肥处理,在初花期和成熟期取样及定期捡拾田间落叶,测定植株干物质积累量、氮素含量及油含量,研究氮肥水平对油菜氮素积累、运转及氮素利用率的影响。结果表明,随着氮肥用量增加,产量和氮素积累总量增加,氮素收获指数和氮素籽粒生产效率逐渐降低。不同处理叶片氮素运转率变幅为76.6%~80.2%,不同氮肥处理间无显著差异。不同处理茎枝氮素运转率变幅为36.0%~57.6%,随着氮肥用量增加而降低。不同处理落叶氮占植株总氮积累量比例的变幅为14.9%~20.3%,随着氮肥用量增加,落叶氮比例逐渐增加。不同处理初花期氮积累量占植株总氮量的变幅为75.5%~90.5%,随着氮肥用量的增加,其比例逐渐增加。初花期期积累氮素对后期产量形成作用较大,注重前期施肥可促进花芽分化,形成更多的有效角果,有利于获得高产。     

植物生长调节剂对油菜生长及冻害后光合作用和产量的调控效应

在油菜始花期喷施不同浓度的脱落酸(ABA)和油菜素内酯(BR),分析其对油菜叶片光合速率和产量的影响;2008年1月低温冰冻天气之后,采用优化浓度的ABA和BR处理,测定油菜叶片的气体交换参数和叶绿素荧光参数,比较角果形态变化规律及产量构成因素。主要结果如下。与对照(CK)相比,喷施76×10^-6 mol L^-1ABA和1×10^-6 mol L^-1BR能延缓叶片光合速率的下降,冻害后喷施该浓度ABA和BR提高了叶片净光合速率(P_n)、光饱和点(LSP)、气孔导度(G_s)、胞间CO₂浓度(C_i)与蒸腾速率(T_r);最大光化学效率(F_v/F_m)、光系统II量子产量(Φ_PSII)与光化学猝灭系数(q_P)均升高,叶绿素初始荧光(F_o)和非光化学猝灭系数(NPQ)降低,ABA和BR处理还提高叶片中叶绿素含量及可溶性蛋白的含量;角果面积增大,BR处理后单株角果数、每角粒数、千粒重及产量都比对照增加,ABA处理可增加角粒数和千粒重, 进而提高油菜的产量。总之,76×10^-6 mol L^-1ABA和1×10^-6 mol L^-1BR能促进油菜生长并有效缓解油菜冻害的影响。     

甘蓝型油菜成熟角果内源激素对带壳种子发芽的影响

以甘蓝型油菜品系832、780、1-1、1-13、8-6为材料,进行了田间带壳种子发芽调查、室内模拟降雨带壳种子发芽试验、种子发芽试验、不同浓度ABA处理的种子发芽试验,并利用HPLC测定了鲜果壳和种子的吲哚乙酸(IAA)、细胞分裂素(CK)和脱落酸(ABA)的含量。结果表明,各供试甘蓝型油菜品系带壳种子发芽率存在极显著差异,而不带壳种子的发芽率在第5 天以后没有显著差异。油菜成熟角果的果壳ABA含量与带壳种子发芽存在显著负相关（r＝－0.8941）,带壳种子发芽主要受果壳所含ABA的抑制;外源ABA能明显抑制种子发芽。     

油菜生育期动态模拟模型的构建

在13个不同熟期甘蓝型油菜品种的2年大田试验中,调查不同播期条件下各品种的生育进程及发育状态。依据油菜生理发育时间恒定原理、生理生态理论及各生育阶段与温度、光周期等外部环境关系,采用Logistic曲线描述油菜光周期效应,谐波分析法分析气温昼夜变化,分段正弦指数函数分析热效应和低温春化效应,结合上述因素构建油菜生育期动态模拟模型;确定模型光周期敏感因子、温度敏感性、生理春化时间和角果期因子4个遗传参数;模型的检验分析表明,对不同播期模拟值与观测值的根均方差平均值为2.67 d,对不同品种模拟值与观测值的根均方差平均值为3.74 d;4个遗传参数值对13个油菜品种聚类分析的结果符合品种特性。因此,该模型在一定范围内可准确揭示油菜对温、光的反应规律,具有较强的可靠性和预测性。     

干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析

以抗旱能力强的油菜Holiday为材料,以干旱处理的样品为Tester,正常水分管理(对照)为Driver构建干旱诱导的甘蓝型油菜叶片正向抑制性消减杂交 (SSH)文库。随机挑选24个阳性克隆进行PCR验证,结果表明,其中23个含有插入片段,平均大小在750 bp左右。将96个阳性克隆测序,并拼接和去除冗余,获得重叠群4条,单拷贝序列82条,平均长度为542 bp。经BlastX程序比对蛋白数据库发现,11条EST没有找到同源性序列,75条有同源序列。KOBAS分析发现,28条EST被定位到67条代谢途径中,根据P值推测,光合中的碳固定、有氧呼吸的电子供体、氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢在植物干旱胁迫中发挥着极为重要的作用。这些EST涉及到的功能中所占比例最大的分别是细胞器(58.82%)、结合(30.77%)和新陈代谢过程(43.72%),表明甘蓝型油菜面对干旱胁迫时,细胞器组件上的功能发挥了重要的作用,结合基因和蛋白被激活,加强了新陈代谢。     

基于生物量的油菜主茎叶片形态参数模拟研究

为了定量油菜主茎叶片形态参数与生物量间的关系,本研究基于2011—2012年和2012—2013年不同品种、移栽密度及施肥水平油菜田间试验,通过观测不同品种和处理油菜叶片长、最大叶宽和叶柄长等形态参数,并分析了上述参数与叶片生物量的关系,构建了基于生物量的油菜叶长、最大叶宽和叶柄长模型。结果表明,在全生育期,不同品种和处理下油菜主茎叶长和最大叶宽均与叶片生物量的平方根成正比,而叶柄长与叶长成正比。所建模型利用截距为0的线性函数描述叶长和最大叶宽随生物量平方根的变化,用直线式描述叶柄长随叶长的变化。经独立试验资料检验,除宁油16叶柄长模型误差较大外,所建模型对其余形态参数均具有较好预测性,为通过生物量将油菜生长模型与形态结构模型结合提供了机理性较强的方法,为建立油菜功能-结构模型奠定了基础。     

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R等位基因特异PCR标记的开发与应用

油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是从抗性突变体M9中克隆获得,抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP,即乙酰乳酸合酶第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因BnALS1R的分子标记,根据该处点突变,结合获得的BnALS3与BnALS1序列,开发30条等位基因特异PCR (allele-specific PCR,AS-PCR)引物,采用筛选出的3条AS-PCR引物在F₂、BC₁和BC₂群体中进行PCR扩增。结果表明,该标记有效检测出群体中存在的3种基因型,其分离比分别为1∶2∶1、1∶1、1∶1,均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得的抗性恢复系进行PCR扩增,结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因BnALS1R目的条带,表明3条标记引物可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。     

甘蓝型油菜BnTT3基因的表达与eQTL定位分析

类黄酮途径中,TT3编码的4-二氢黄铜醇还原酶是参与原花色素和花青素合成的关键酶。为了明确该基因可能的上游调控网络,利用黄籽母本GH06和黑籽父本ZY821构建的遗传图谱,以Bn TT3基因在高世代重组自交系群体中随机选取的94个株系花后40 d种子的表达量作为性状,采用复合区间作图法进行e QTL分析。结果共检测到5个表达量相关的e QTL,分别位于A03、A08、A09和C01染色体,单个e QTL解释表型变异的5.22%~24.05%。A09染色体上存在2个主效e QTL,单个e QTL分别解释24.05%和16.55%的表型变异,分别位于标记KS10260~KBr B019I24.15和B055B21-5~KS30880之间,微效e QTL分布于A03、A08和C01染色体上。A09染色体上的2个主效e QTL区间(包含200 kb侧翼序列)与拟南芥、白菜、甘蓝和芸薹族近缘物种基因组同源区段具有很好的共线性关系。基因注释结果表明检测到的e QTL均为trans-QTL,2个主效e QTL区段共包含78个基因,包括MYB51、MYB52和b ZIP5转录因子,可能为Bn TT3基因的上游直接调控因子,对这些基因功能的深入分析将有助于阐明甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子调控机制,为黄籽候选基因的克隆筛选奠定基础。     

油菜叶片气孔导度与冠层光谱植被指数的相关性

利用冠层光谱实时、无损和定量监测植物叶片气孔导度,对于改善作物水分利用效率以及产量和品质预测预报具有十分重要的意义。本研究采用裂区设计法(宁油18和宁油16两个品种)、两个供氮水平(N₁₈₀：纯氮180 kg hm^-2、P₂O₅ 120 kg hm^-2、K₂O 180 kg hm^-2和硼砂15 kg hm^-2;N₀：CK)于2007-2008年测定油菜冠层光谱反射率、叶片气孔导度以及叶面积指数(LAI)和叶片鲜、干生物量,利用各波段光谱反射率组合产生的植被指数,分析油菜叶片气孔导度的变化规律及其与光谱植被指数的相关性,从而建立光谱植被指数对叶片气孔导度的估算模型。结果表明,在整个生育期油菜叶片气孔导度呈“双峰”变化, LAI和叶片鲜、干生物量均呈单峰曲线变化;开花前光谱植被指数与油菜叶片气孔导度和油菜冠层叶片平均气孔导度均呈极显著正相关,且光谱植被指数对油菜冠层叶片气孔导度的拟合效果好于对油菜叶片气孔导度的。光谱植被指数与冠层叶片气孔导度的量化关系可为今后快速、无损、大面积的油菜作物气孔导度估算奠定一定基础。     

甘蓝型油菜DH群体苗期抗旱性的评价

中国油菜主产区常常受到秋冬旱和春旱危害而影响产量及品质。本文通过盆栽试验,以株高(PH)、根长(RL)、地上部干重(SDW)、根干重(RDW)、根冠比(R/S)、总干重(TDW) 6个性状的抗旱系数作为抗旱性评价指标,对甘蓝型油菜DH(doubled haploid)群体的118个株系及其亲本进行苗期抗旱性评价,筛选极端抗旱DH系。结果表明,与对照相比,干旱严重抑制了甘蓝型油菜苗期的生长,6个评价指标均表现出显著差异,其中根干重的变异系数最大;在对照和干旱条件下,群体各株系各性状均表现出超亲连续分离,大部分呈正态分布,抗旱条件下的分离更为明显;相关性分析表明,地上部干重、根干重和总干重抗旱系数可作为甘蓝型油菜苗期抗旱性的主要评价指标;