一个与小麦雄性不育育性转换相关的MADS-box转录因子基因

为了揭示YS型小麦温敏雄性不育育性转换的基础, 构建了该类型不育系A3017的不育和可育幼穗正、反杂交的两个SSH-cDNA文库。经文库比较, 在不育文库中筛选出一个与MADS-box基因同源的EST序列(GenBank登录号: 36925702)。以该EST序列的同源性比对和拼接结果为依据, 设计引物对该基因在可育和不育幼穗中的表达进行了RT-PCR分析, 结果表明, 该基因在不育幼穗中表达量较高, 可育幼穗中表达量很低。对不育幼穗中扩增出的cDNA片段进行克隆测序, 获得了666 bp的cDNA序列。序列分析表明, 该片段编码160个氨基酸, 具有MADS-box转录因子的典型结构域K-box, 被定名为TaMS-MADSbox, 与一个小麦MADS box转录因子基因WAG的氨基酸序列的相似性为94%。进一步以3种不同类型的小麦雄性不育系和保持系的幼穗cDNA为材料, 利用半定量RT-PCR对该基因的表达模式分析发现也存在类似差异, 该基因在不育系幼穗中表达量较高, 而保持系幼穗中表达量较低。以上分析表明, 该MADS-box转录因子基因的表达与小麦雄性不育系的育性转化相关, 表达量高时表现雄性不育, 表达量低时表现雄性可育。     

宁夏枸杞雄性不育基因ms2的克隆及表达分析

本研究以宁夏枸杞为材料,根据GenBank上已经登录的该基因的保守区设计简并引物,通过RTPCR扩增获得基因保守片段,利用RACE技术获得该基因3'端序列。最终,经拼接后得到一个长约1 802 bp的ms2基因片段(登录号为JQ341412.1),终止密码子为TAG,3'端包含非编码区和Poly A尾巴。相应编码基因片段527个氨基酸的肽段。生物信息学分析表明,ms2基因序列中含有NAD(P)H区域,该区域含有显著的TGXXGXXG结构单元,以及微体结合信号区域。从第44个氨基酸到第346个氨基酸为NAD结合区,从第459个氨基酸到第517个氨基酸为雄性不育C-末端区。同源性检索表明,ms2基因片段氨基酸序列与亚麻、葡萄、大豆、拟南芥和青菜的同源性分别为71%、71%、72%、65%和66%。系统进化树分析表明,宁夏枸杞ms2基因与葡萄的亲缘关系最近,与毛果杨、亚麻以及十字花科的植物聚为一类,而与江南卷柏的亲缘关系最远。RT-PCR分析表明,ms2基因在可育花蕾的2、3时期表达非常强,而在不育花蕾的2、3时期表达较弱。     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS2A及其保持系的花药蛋白质组比较研究

大豆质核互作雄性不育系NJCMS2A是以栽培大豆组合（N8855 ´ N1628）F₂不育株为母本,以N1628为父本,通过连续回交选育而成的,N1628（或NJCMS2B）为其同型保持系。对NJCMS2A和NJCMS2B的二胞花粉期花药进行蛋白质组比较分析,获得重复性好的双向电泳图谱,在分子量18.4~116.0 kD、等电点4~7线性范围内,检测到约217个蛋白点,其中差异表达蛋白点25个,包括在NJCMS2A 中出现而在NJCMS2B中缺失的蛋白点13个,在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中出现的蛋白点10个,另有2个蛋白点的表达量在NJCMS2B中比在NJCMS2A中明显增强。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术对差异表达蛋白进行分析,获得肽质量指纹图谱,用Mascot软件搜索NCBInr数据库,鉴定出14个差异表达蛋白,其中10个在NJCMS2A中出现而在NJCMS2B中缺失和4个在NJCMS2A中缺失而在NJCMS2B中出现。对热激蛋白22 kD、半胱氨酸蛋白酶、V型H+-ATP酶A亚基、MADS盒蛋白和淀粉分枝酶等主要差异蛋白进行功能分析,推测不育系NJCMS2A雄性不育性可能与能量代谢紊乱、细胞程序化死亡（PCD）、淀粉合成受抑制和花器官发育调节基因作用失控等有关。     

大白菜育性相关基因BRLSP-55的获得与验证

雄性不育的利用是大白菜制种的重要手段,获得大量育性相关基因可为了解大白菜雄性不育分子机制提供线索。采用cDNA-AFLP技术寻找差异条带,利用RT-PCR经序列比对并推测其功能。利用cDNA-AFLP方法从大白菜雄性不育两用系“AB01”的不育和可育花蕾中找到一个仅在可育花蕾中表达,而在不育花蕾中不表达的差异片段;经测序分析表明所得序列大小为351 bp,将其命名为BRLSP-55;并通过RT-PCR方法得到了验证;经序列比对初步判定该基因与拟南芥硫堇蛋白(Thionin Protein)的亲缘关系较近,所获得育性相关基因BRLSP-55可能为一种硫堇蛋白,在大白菜雄性不育机制中可能起重要作用。     

香蕉MuMA DS2的克隆、序列分析和表达分析

根据抑制缩减文库获得的一个MADS-box基因片段,从香蕉果实cDNA文库中,采用RT-PCR技术分离获得一个全长cDNA,经序列测定和同源性分析表明,该cDNA含705bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸残基的MADS-box蛋白,将其命名为MuMADS2。MuMADS2具有植物MADS-box基因家族中特有的M、I、K和C四个结构域,与芦笋、风信子、蝴蝶兰和百合的MADS-box基因的氨基酸序列存在很高的一致性（82%、78%、77%和75%）。将MuMADS2与其它植物来源的MADS-box基因进行序列比较发现,MuMADS2属于MADS-box基因的AGAMOUS亚族的D世系。RT-PCR分析表明,MuMADS2仅在生殖器官（花和果）中表达,在营养器官（根、茎和叶）中不表达。进一步分析发现MuMADS2仅在雄花和雌花的子房、由雌花发育而成的果实中表达,而在雄花和和雌花的柱头和花柱都不表达。推测MuMADS2可能在果实的发育和成熟过程中起作用。     

巴西橡胶树HbMADS5的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,通过PCR克隆了1个编码巴西橡胶树MADS-box转录因子的基因,命名为Hb MADS5。Hb MADS5全长1 077 bp,编码358个氨基酸,推测Hb MADS5蛋白分子量为40.75 k D,等电点为6.38。氨基酸序列比对分析表明,Hb MADS5具有MADS-box家族典型的MADS-box保守结构域,与蓖麻、葡萄、麻风树、甜橙、木本棉、蒺藜状苜蓿等物种的MADS-box家族成员具有较高的同源性,分别为79%、74%、72%、70%、65%和59%。Hb MADS5与麻风树中的1个MADS-box成员亲缘关系最近。Hb MADS5在巴西橡胶树根、茎、叶、花和胶乳等中都有表达,其中在胶乳中表达量最高,在根中表达量最低;茉莉酸甲酯和乙烯能诱导Hb MADS5的表达,茉莉酸甲酯处理12 h后Hb MADS5表达量提高了10倍,乙烯处理48 h后Hb MADS5表达量提高了2倍。本研究将为进一步研究Hb MADS5在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

蒙古羊卵巢组织差异表达基因ADAMTS1的电子克隆及RT-PCR验证

在单、双羔蒙古羊卵巢组织抑制性消减杂交的基础上,以其差异表达片段ADAMTS1基因序列为种子序列,采用GenBank的BLAST检索系统首先对蒙古羊的ADAMTS1基因序列片段进行了电子延伸,其次在获得蒙古羊AD-AMTS1基因的cDNA全序列后设计引物,采用RT-PCR方法进一步克隆了蒙古羊ADAMTS1基因。结果显示,试验所得序列与电子延伸序列的同源性为99.4%,序列长为2 420 bp包括836 bp 3'UTR区域和1 578 bp的完整开放读码框,共编码525个氨基酸。Blastn比对发现蒙古羊ADAMTS1基因序列与牛、猪和人的同源性分别为94%,87%,82%;对氨基酸序列进行blastp比对发现与牛、猪和人的同源性分别为91%,90%,87%。采用SMART程序预测其结构功能域发现蒙古羊ADAMTS1蛋白质有4个结构功能域:1个富半胱氨酸结构域和3个血小板反应蛋白。     

一个甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因克隆和表达分析

利用甘蓝型油菜与播娘蒿融合杂种中的不育株与甘蓝型油菜杂交、回交，得到细胞质雄性不育系NJ65A。根据pol和nap雄性不育高度相关的基因orf224和orf222设计兼并引物，从NJ65A植株中克隆得到一个长度为675bp的基因，命名为orf224-NJ65A。该基因编码224个氨基酸，氨基酸序列与orf224、orf222和orf220序列相似性分别为：70％、53％、60％。RT—PCR表达分析表明：orf224-NJ65A在所检测的组织中都有表达，但在花、花蕾和茎中的表达量较大。推测orf224-NJ65A与细胞质雄性不育有关。     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

甜菜细胞质雄性不育相关基因的克隆表达及CMS的相关性研究

已有的研究表明,线粒体atpA基因和orf187片段与作物雄性不育关系密切。为了研究atpA基因和orf187片段与甜菜细胞质雄性不育之间的关系,采用同源序列法分离克隆了甜菜体内atpA和orf187序列;序列分析揭示这2个片段序列在不育系和相应保持系间存在差异,进一步利用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术分析了两系的atpA基因和orf187片段的表达情况。结果表明,与保持系相比,atpA在不育系中发生了碱基的置换及插入;orf187在不育系中缺失6个碱基,而在保持系中多了6 bp的重复序列;基因表达分析也显示,不育系atpA在花蕾发育的前2个时期表达量明显低于相应的保持系,而在大花蕾期其表达量又高于相应的保持系;orf187在不育系小花蕾时期表达量明显高于相应的保持系,随着花蕾的发育,该序列在不育系中的表达逐渐减弱并明显低于对应保持系中的表达量。推测atpA和orf187的结构变异及异常表达与甜菜细胞质雄性不育有着密切关系。     

萝卜雄性不育系及其保持系几种酶活性研究

本文利用多代纯合的不育性稳定的萝卜雄性不育系A1、A5为材料,以其相应的保持系B1、B5为对照,对POD、SOD、PAL及淀粉酶的活性进行了分析比较.结果表明,萝卜雄性不育性的表现仅与花蕾的POD和淀粉酶活性的增强有关,而与SOD及PAL活性无关.同时,在叶片中,以上酶的活性在不育系和保持系间差异不明显.认为萝卜雄性不育性的基因可能仅在生殖器官中表达,而对营养器官无影响.     

Discovery of new male-sterile cytoplasm sources and development of a new cytoplasmic-nuclear male-sterile line NJCMS3A in soybean

Most of the cytoplasmic-nuclear male-sterile (CMS) lines of soybean were developed only from a limited cytoplasm sources and performed not as good as required in hybrid seed production, therefore, to explore new male-sterile cytoplasm sources should be one of the effective ways to improve the pollination and hybridization for a better pod-set in utilization of heterosis of soybeans. In the present study, total 80 crosses between 70 cultivated and annual wild soybean accessions and three maintainers (N2899, N21249, and N23998) of NJCMS1A were made for detecting potential new sources with male-sterile cytoplasm. The results showed that in addition to the crosses with N8855.1 (the cytoplasm donor parent of NJCMS1A) and its derived line NG99-893 as cytoplasm parent, there appeared three crosses, including N21566 × N21249 and N23168 × N21249, with male-sterile plants in their progenies. According to the male fertility performance of backcrosses and reciprocal crosses with the tester N21249, the landrace N21566 and annual wild soybean accession N23168 were further confirmed to have male-sterile cytoplasm. Accordingly, it was understood that the source with male-sterile cytoplasm in soybean gene pool might be not occasional. The results also showed that the genetic system of male sterility of the newly found cytoplasm source N21566 was different from the old cytoplasm source N8855.1, while N23168 was to be further studied. Based on the above results, the derived male-sterile plants from [(N21566 × N21249) F₁ × N21249] BC₁F₁ were back-crossed with the recurrent parent N21249 for five successive times, and a new CMS line and its maintainer line, designated as NJCMS3A and NJCMS3B, respectively, were obtained. NJCMS3A had normal female fertility and stable male sterility. Its microspore abortion was mainly at middle uninucleate stage, earlier than that of NJCMS1A and NJCMS2A. The male fertility of F₁s between NJCMS3A and 20 pollen parents showed that 7 accessions could restore its male fertility and other 13 could maintain its male sterility. The male sterility of NJCMS3A and its restoration were controlled by one pair of gametophyte male-sterile gene according to male fertility segregation of crosses between NJCMS3A and three restorers. The nuclear gene(s) of male sterility in NJCMS3A appeared different from the previously reported CMS lines, NJCMS1A and NJCMS2A. The development of NJCMS3A demonstrated the feasibility to discover new CMS system through choosing maintainers with suitable nuclear background.     

Development of a cytoplasmic male‐sterile line NJCMS4A for hybrid soybean production

Cytoplasmic male‐sterile (CMS) lines are being used to produce hybrid seeds. Thus far, four CMS sources in soybean [Glycine max (L.) Merr.] have been reported in China. However, they are not sufficient or efficient in meeting the requirements of commercial soybean hybrid seed production. In this study, 33 varieties were tested for CMS using 45 crosses among 37 landraces and 17 annual wild soybean accessions (Glycine soja Sieb. et Zucc.). The cross of N23661 × N23658 showed partial to complete male sterility in backcross generations, while the corresponding reciprocal cross showed normal male fertility. Thus, the cytoplasm of N23661 is male‐sterile, the continuously backcrossed line is a male‐sterile line (designated NJCMS4A), and N23658 is its maintainer (designated NJCM4B). The male fertility of NJCMS4A was restored by another accession, Nansheng9403. Accordingly, NJCMS4A along with its maintainer and restorer composes a complete set of three lines for producing hybrid soybean. Using mitochondrial markers and sequence analyses, NJCMS4A is a CMS line with its cytoplasm not identical to the four previously reported CMS sources in soybean.     

Development of a new cytoplasmic-nuclear male-sterility line of soybean and inheritance of its male-fertility restorability

Based on previous work, a new cytoplasmic‐nuclear male‐sterile line NJCMS2A along with its maintainer NJCMS2B of soybean was released through four episodes of nuclear substitution backcrossing with male‐sterile plants of (N8855 × N1628)F₂ as donor parent and N1628 as recurrent parent. The male sterility of NJCMS2A was complete and female fertility was normal. A series of restorers from different sources were screened out and evaluated. It was found that from the crosses between NJCMS2A and its restorers, two pairs of duplicate dominant genes, allelic to those of NJCMS1A, controlled the inheritance of fertility restorability of NJCMS2A.     

大豆质核互作雄性不育系NJCMS3A双亲雄性育性基因的SSR标记

利用大豆质核互作雄性不育系NJMCS3A的质、核供体亲本N21566和N21249构建F₂和BC₁F₁育性分离群体进行雄性育性的遗传分析与基因定位。结果表明, F₁正反交可育,F₂和BC₁F₁的可育株与不育株分离比例经χ²测验分别符合3∶1和1∶1,表明NJCMS3A供体亲本雄性育性由一对基因控制,可育等位基因为显性。该基因可能是NJCMS3A的一个恢复基因。选用793对SSR引物对F₂和BC₁F₁群体分别进行育性基因定位,发现该育性基因位于O连锁群上,在Satt331和Satt477标记之间,与Satt331、CSSR133和Satt477标记距离的次序一致,分别为8.1~10.4 cM、11.4~16.4 cM、13.3~19.2 cM。     

大豆质核互作雄性不育研究进展

利用雄性不育进行杂种优势育种是提高大豆产量的有效措施之一。目前发现的大豆雄性不育类型主要包括细胞核雄性不育、光温敏雄性不育和质核互作（细胞质）雄性不育。而对大豆杂种优势利用具有实际应用价值的是质核互作雄性不育。简要回顾了大豆质核互作雄性不育的发现过程,总结了通过三系配套技术实现的大豆杂交育种的现状与关键生产技术等,并从细胞学、分子生物学和蛋白质组学等方面综述了大豆质核互作雄性不育形成机理方面的研究进展。最后提出不同研究单位之间应该加强协作,通过合理的研究材料交流来加快大豆质核互作雄性不育机理的研究,以使其能够被更好地应用于大豆杂种优势育种中。     

油菜育性相关多聚半乳糖醛酸酶基因MF6的获得及表达分析

本研究目的在于利用化学杀雄剂"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜R121产生雄性不育,并对花蕾中的差异表达基因进行分离、筛选及定量表达分析。首先,通过抑制消减杂交技术(SSH)和反向Northern斑点杂交技术,分离和筛选出在雄性不育花蕾中差异表达的基因片段。然后,将差异片段测序后在NCBI数据库中进行同源性比对及功能分析。最后,对差异表达基因进行反转录荧光定量表达(RT-QPCR)分析。本研究从筛选出来的6个阳性克隆中获得一个与多聚半乳糖醛酸酶基因(MF6)100%同源的基因片段,该基因被认为与花粉生长发育及花粉成熟密切相关。对MF6基因在不同长度及不同育性花蕾中的表达量进行了定量分析,结果显示,MF6基因在雄性可育花蕾中的表达量均高于雄性不育花蕾,且在蕾长1.00mm～1.50mm和3.50mm～4.00mm时分别达到了18.53倍和43.15倍的差异。因此,我们推测"化杀灵WP1"主要通过抑制花粉母细胞减数分裂时期中MF6基因的表达,使花粉产生败育;同时,MF6基因的表达可能也与花丝的伸长生长有关。     

烟草细胞质雄性不育系及其保持系的花蕾差异蛋白质分析

为探讨烟草雄性不育的分子遗传机理,对烟草细胞质雄性不育系和保持系进行差异蛋白质组学研究。采用固相pH梯度SDS-PAGE双向电泳,对烟草细胞质雄性不育系MSK326及其保持系K326雄蕊原基分化期、四分体时期及单核时期花蕾蛋白质进行分离,经考马斯亮蓝染色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。使用PDQuest软件分析蛋白质图谱,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱分析,然后用Mascot软件对NCBInr数据库搜索。在分子量14.4~97.6 kD、等电点4~7线性范围内,检测到约365个蛋白点,其中7个蛋白质点在保持系中出现, 在不育系中缺失,分别被鉴定为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、多酚氧化酶、Patatin homolog蛋白、PSI 9 kD蛋白4类蛋白,推测不育系MSK326雄性不育性可能与营养代谢紊乱、间接抑制雄性器官发育、养分供给不足、免疫能力低和能量转移受到抑制等有关。